PCR后电泳条带亮暗差异明显
大家好,
想请教个问题,我根据某个物种的重测序结果,想筛选引物,以筛选某个性状。比如,两个果实甜涩的性状,目前筛到了某个引物,在甜味果实中应该有这段序列,在涩味果实中,该序列理论上应该是没有的。。
现在出现的问题是,我用这个引物PCR后,跑琼脂糖电泳发现,甜味果实DNA的PCR条带很亮,而涩味果实DNA的PCR条带也是有的,但是很暗很暗,两个条带的亮暗差异很明显。我做了多个重复,即提了多个DNA,结果都是甜味果实PCR条带很亮,涩味果实PCR条带特别暗。
问题如下,
1, 我提的DNA浓度什么的基本是差不多的,可是为什么一个条带很暗一个条带很亮呢。。
2, 理论上应该一个条带有,另一个没有条带。目前发现一个条带很暗一个条带很亮。既然都有条带,那这是不是说明,这个引物效果不好,不能用于筛选这个甜涩性状?
3,如果DNA浓度差不多,但是电泳条带一个亮,一个暗,可以不可以说,亮条带的那个果实的该基因表达量高,暗条带的那个果实的该基因表达量低?
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京公网安备 11010802022153号
有没有空白对照,就是不加基因组的,看看暗的条带是不是背景值。条带亮,可能意味着拷贝数多,暗为基因拷贝数低。由于有假基因存在的可能性。可以把条带扩增这一段对照基因组,来找甜和涩的差异。
你说到“可以把条带扩增这一段对照基因组,来找甜和涩的差异。"
意思是,把两个PCR的条带进行测序,然后跟基因组比较,看差异吗
,
做阴性对照看下是不是也有暗的条带,有的话要么引物不行,要么试剂污染了,全换了重做一次,如果还是有暗的条带,重新设计引物,或者亮的和暗的条带测序看下是不是你要的序列。