蛋白诱导表达低或不表达
以前表达蛋白一直是包涵体的问题,这次头一次遇到诱导不出来的:
第一张图是IPTG诱导前和诱导后的对比,几乎没有差别.蛋白大小应该是92kDa,只能看到很浅的条带
可以肯定的是蛋白是可溶的,因为以前表达过这个蛋白,这一次我在蛋白N端的his-tag后面添了几个氨基酸,增加了一个酶切位点,便于纯化后把histag切掉,结果谁想就不表达了
表达条件是LB, 19度,1mM IPTG,过夜
BL21 DE3 codon plus, pet28质粒
其实以前这个蛋白一直有诱导表达量不好的问题. 第2张图,右边的7个泳道是同样这个蛋白但是我没有在histag后面添加个酶切位点.左边7个泳道是另一个蛋白用同一个载体质粒,完全一致的插入位点和完全一致的诱导条件,就诱导表达得很好
亲们有什么优化意见吗?
histevh1induction.jpg
ecatbody_and_hish1.jpg
[ Last edited by fuyuandj86 on 2013-8-9 at 22:47 ]
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京公网安备 11010802022153号
关键问题是你要干啥？都能看见带了纯化出来干啥不够啊？不用担心了，摇500ml, 纯出来做实验吧。。。
主要是第一张图,N端添加了7个氨基酸以后诱导前诱导后几乎没差别了...
这个是要用来做高通量筛选.
以第二张图右边组的诱导量还是可以接受的,我摇了10L,最后搞出来6-7mg
，
简单的加个酶切位点就发生了如此大的变化，一般是不可能的，所以我建议你在此测序看看，确保没有移码！
nature以前有一篇论文专门讨论了稀有氨基酸对蛋白表达影响很大，所以我觉得还是非常有可能变小的，移码可能性不大。我的蛋白表达量是楼主的1/N,SDS-PAGE上看不到差别，Western才能看到表达。多摇点，纯出来就好了。