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PCR之前能扩出来，后来再做却扩不出来，求高手指教！！！

作者 sunchenli: 来源: 小木虫 350 7 举报帖子

我自己设计的一对引物，同样的反应体系，同样的PCR循环参数，先前做几次都能扩出来，后来再做却扩不出来了，不管换什么样的条件，总是什么条带都没有。我只有13个金币，都拿出来了，跪求各位PCR高手指教啊，谢谢了啊！！
附引物序列：上：GCATCGCCAACTTCTTCC
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精华评论

sunchenli

补充一下，我的引物放了已经有差不多半年了，是宝生物合成的，我再想问下，这么长时间引物会不会出问题了？？？？
mzchongchong

你的引物如果正确的存放在-20度，半年的时间应该不会有问题的.
我之前跟你遇到的问题一样，换了另一种聚合酶，然后就得到了目的条带，建议你换一种聚合酶试试.
sunchenli

引用回帖:
3楼: Originally posted by mzchongchong at 2013-01-21 18:19:33
你的引物如果正确的存放在-20度，半年的时间应该不会有问题的.
我之前跟你遇到的问题一样，换了另一种聚合酶，然后就得到了目的条带，建议你换一种聚合酶试试.

再请问下，引物一般最多能反复冻融几次？我的引物已经被我冻融过4-5次了，会降解吗？
qitianyang

引用回帖:
4楼: Originally posted by sunchenli at 2013-01-22 09:47:23
再请问下，引物一般最多能反复冻融几次？我的引物已经被我冻融过4-5次了，会降解吗？...

引物反复冻融肯定是不好的。建议您下次贮存引物时还是应该配制好100uM的母液以后分装几支，避免反复冻融同一支。如果还有母液就重新稀释吧。没有母液的话倒不如重新订引物了，几十块钱，3天左右。应该比纠结于此合算。还有换一支聚合酶也是可行的，出问题的不一定就是引物
，
yang1279

楼主做实验要做对照啊这样很容易找出是什么原因（模版，引物还是体系都能找出来）
sunchenli

引用回帖:
5楼: Originally posted by qitianyang at 2013-01-22 10:39:39
引物反复冻融肯定是不好的。建议您下次贮存引物时还是应该配制好100uM的母液以后分装几支，避免反复冻融同一支。如果还有母液就重新稀释吧。没有母液的话倒不如重新订引物了，几十块钱，3天左右。应该比纠结于此合 ...

聚合酶我已经重订了一个公司的，今天在试，谢谢了
sunchenli

引用回帖:
6楼: Originally posted by yang1279 at 2013-01-22 11:20:47
楼主做实验要做对照啊这样很容易找出是什么原因（模版，引物还是体系都能找出来）

我的不需要对照，因为是自己设计的引物，模板也是已知的阳性，能扩出来就扩出来，不能也就不能了，有无对照并无关系