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PCR出现假阴性的对策

作者 自然_法则
来源: 小木虫 150 3 举报帖子
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虫子最近在做PCR,目的条带出现了,而且效果也比较理想,退火温度已经很高了,但仍然还有假阴性存在,离目的条带很近丰度很低,此外无其他杂带。问下大师们有没有治理假阴性的良方,谢谢 返回小木虫查看更多

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  • 精华评论
  • 指上阡陌

    升高退火温度
    增加退火时间
    增加延伸时间
    少用引物
    少用模板
    少用酶
    这是常用的方法,本人前些时做这个,不出目标带,但是出现比目标带少100bp的带,另一个基因已经p出来了,所以试剂没问题,于是采取增加延伸时间,结果多跑出来一条比目标带大300bp的带,现在准备继续探索,希望可以继续交流

  • 水牛默默

    最好附张图片!
    1.其他PCR组分不换,单独换新的ddH2O作为阴性模板试试。一般阴性的话都是怀疑阴性模板污染。如果换水后仍是由杂带,再考虑换套新的PVR组分,考虑是否是PCR的酶,dNTPs,Buffer污染等。
    2.是否是引物设计有问题/造成非特异性扩增呢?如果是的话就重新设计引物吧,很便宜的。
    3.第三,你可以把目的条带切割下来,回收后用作模板,二次扩增,这样如果是非特异性扩增的话基本可以去除。
    简单给几点建议,希望对你能有多帮助,如有问题,可以继续讨论!

  • 自然_法则

    引用回帖:
    2楼: Originally posted by 指上阡陌 at 2012-10-05 18:49:09
    升高退火温度
    增加退火时间
    增加延伸时间
    少用引物
    少用模板
    少用酶
    这是常用的方法,本人前些时做这个,不出目标带,但是出现比目标带少100bp的带,另一个基因已经p出来了,所以试剂没问题,于是采取增加延伸 ...

    我目的条带也是出来了,温度很高了,只有目的条带和一条假阴性

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