虫子最近在做PCR,目的条带出现了,而且效果也比较理想,退火温度已经很高了,但仍然还有假阴性存在,离目的条带很近丰度很低,此外无其他杂带。问下大师们有没有治理假阴性的良方,谢谢 返回小木虫查看更多
升高退火温度 增加退火时间 增加延伸时间 少用引物 少用模板 少用酶 这是常用的方法,本人前些时做这个,不出目标带,但是出现比目标带少100bp的带,另一个基因已经p出来了,所以试剂没问题,于是采取增加延伸时间,结果多跑出来一条比目标带大300bp的带,现在准备继续探索,希望可以继续交流
最好附张图片! 1.其他PCR组分不换,单独换新的ddH2O作为阴性模板试试。一般阴性的话都是怀疑阴性模板污染。如果换水后仍是由杂带,再考虑换套新的PVR组分,考虑是否是PCR的酶,dNTPs,Buffer污染等。 2.是否是引物设计有问题/造成非特异性扩增呢?如果是的话就重新设计引物吧,很便宜的。 3.第三,你可以把目的条带切割下来,回收后用作模板,二次扩增,这样如果是非特异性扩增的话基本可以去除。 简单给几点建议,希望对你能有多帮助,如有问题,可以继续讨论!
升高退火温度
增加退火时间
增加延伸时间
少用引物
少用模板
少用酶
这是常用的方法,本人前些时做这个,不出目标带,但是出现比目标带少100bp的带,另一个基因已经p出来了,所以试剂没问题,于是采取增加延伸时间,结果多跑出来一条比目标带大300bp的带,现在准备继续探索,希望可以继续交流
最好附张图片!
1.其他PCR组分不换,单独换新的ddH2O作为阴性模板试试。一般阴性的话都是怀疑阴性模板污染。如果换水后仍是由杂带,再考虑换套新的PVR组分,考虑是否是PCR的酶,dNTPs,Buffer污染等。
2.是否是引物设计有问题/造成非特异性扩增呢?如果是的话就重新设计引物吧,很便宜的。
3.第三,你可以把目的条带切割下来,回收后用作模板,二次扩增,这样如果是非特异性扩增的话基本可以去除。
简单给几点建议,希望对你能有多帮助,如有问题,可以继续讨论!
我目的条带也是出来了,温度很高了,只有目的条带和一条假阴性
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