当前位置: 首页 > 生物科学 >【求助/交流】请教XhoI与EcoRI双酶切问题

【求助/交流】请教XhoI与EcoRI双酶切问题

作者 yusuya
来源: 小木虫 300 6 举报帖子
+关注

本人用pDsRed-Monomer-C1质粒用XhoI与EcoRI双酶切后,想连接一段目的基因,可是总是连接不上,而且一直是自连,CAGATC‘TCGA’GCTCAAGCTTCG‘AATT’CT
                                                            GTCTAG‘AGCT’CGAGTTCGAAGC‘TTAA’GA
                                                                         XhoI                             EcoRI   
希望高人指点下都什么原因会造成自连呢?两个酶切的位点很近是不是会造成影响呢? 返回小木虫查看更多

今日热帖
  • 精华评论
  • genewind

    双酶切效率会低点,你可以试试按顺序一个酶切后沉淀纯化后再用另一个酶切,一般1ug的DNA用5个U的酶。

  • amilie030312

    先单酶切看看,看是否效率一样,确定两个酶都没有问题。如果两个酶都确定了没问题就用热敏磷酸酶做一下去磷酸化,这样起码能减少自连的情况发生几率。连接的时候做一下自连的做对照,确认是否真的是自连了。其他的暂时没想到。

  • 雨中蜗牛

    你要接的目的片段是不是没有黏性末端啊
    pcr是不是延伸完就拿出来了,没有经过4度20分钟啊?
    这样的话就不好接

  • 小白3521

    引用回帖:
    Originally posted by 雨中蜗牛 at 2010-04-15 17:32:15:
    你要接的目的片段是不是没有黏性末端啊
    pcr是不是延伸完就拿出来了,没有经过4度20分钟啊?
    这样的话就不好接

    这是什么原理啊

  • j2

    这2种酶是不是可以用同一缓冲液的
    可以的话,一般双酶切的酶用量在5-10倍,酶切会比较完全

  • bio830805

    我记得XhoI和EcoRI,如果使用NEB的酶的话,双酶切要用EcoRI对应的Buffer. 不过对于第一次做酶切质粒,单酶切也要一起做。
    如果单酶切没问题,双酶切也应该问题不大,虽然距离比较近,效率低一些。
    如果再不行,那就改为分步酶切,先做难切的那个,但是Buffer要用两者都适用的那种;
    如果还不行,那就先连接到克隆载体上,比如pGEM之类的,因为用Taq酶PCR的时候会在两个末端加上A,而克隆载体一般都是线性的载体,两端都有T,所以按照试剂盒的操作很快就能完成,这样在酶切的肯定是没问题的,就是花点时间而已(我开始的时候也遇到酶切不行,自连的情况,不过我个人不建议用碱性磷酸酶来避免自连,觉得会降低效率,所以后来就用克隆载体先连接,在酶切,这样就好了)。
    如果还是不行,那你只能用绝招了——LIC(Ligation independent cloning),具体你可以参考文献,现在这个方法已经用的很成熟了,我们实验室还发明了chemical ligation的方法,只要10min就可以把基因片段和载体连上,而且连接效率95%,自连几乎为零,我已经用这个方法构建基因库了,不过要等paper发了再和大家分享吧。

    这些是我的经验,希望对你有用,

猜你喜欢