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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 求助啊！cDNA扩增不出特异性条带！
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助啊！cDNA扩增不出特异性条带！ 已有1人参与

脾脏中提RNA，后用两步法进行特异性扩增。图最左是DL2000，之后从左往右依次的扩增条带本来应该是600多，1000多，500多。但是PCR（预变性94℃ 5min 30个循环94℃1min 55℃1min 72℃70s 之后72摄氏度7min）后电泳（2%的胶）出现很多非特异性扩增（只有600多那个出现了很浅很浅的特异性条带）。。。

1.没有出现目的条带，出现很多非特异性扩增，请问是引物的特异性问题吗？还是PCR温度的问题？？
2.那个在点样孔边缘很细很亮的条带是什么啊？？是不是RNA没提好导致cDNA出现了问题啊？？

求助啊！cDNA扩增不出特异性条带！
2016_1_30 2016-01-30 13 时 36 分_副本.jpg
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1楼 2016-01-30 23:41:29
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Xie_Zijing

新虫 (初入文坛)
应该是引物的问题，建议重设引物

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4楼2016-01-31 08:35:48
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新欣小生

银虫 (小有名气)
跑的总RNA？

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时间会证明一切
2楼2016-01-31 00:19:39
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 新欣小生 at 2016-01-31 00:19:39
跑的总RNA？

用cDNA跑的哈！
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3楼2016-01-31 01:11:23
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Xie_Zijing

新虫 (初入文坛)
PCr非特异性条带过多也可适当调高退火温度

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5楼2016-01-31 08:37:39
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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)
提高一下退火温度，比如60度或者更高，还有引物加的太多了，适当减少点

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6楼2016-01-31 08:39:52
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by dragonhmw at 2016-01-31 08:39:52
提高一下退火温度，比如60度或者更高，还有引物加的太多了，适当减少点

我是用的10微升体系跑的，上游下游各0.4微升，cDNA0.4微升，这样的话引物还是多吗？？

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7楼2016-01-31 13:34:39
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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lixuxiao12 at 2016-01-31 13:34:39
我是用的10微升体系跑的，上游下游各0.4微升，cDNA0.4微升，这样的话引物还是多吗？？
...

引物的浓度是10mM, 0.2微升引物就可以了
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8楼2016-01-31 17:47:14
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by dragonhmw at 2016-01-31 17:47:14
引物的浓度是10mM, 0.2微升引物就可以了...

这样啊  ！我再跑跑看！
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9楼2016-01-31 17:51:35
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jinghun2004

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lixuxiao12: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2016-02-02 12:13:58
反转cDNA前Total RNA  需要用DNase I消化一下；从电泳图看引物应当减少，另外1000bp以下目的片段延伸时间有40S就足够了 。
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10楼2016-02-02 10:40:52
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