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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助啊!cDNA扩增不出特异性条带! 已有1人参与

脾脏中提RNA,后用两步法进行特异性扩增。图最左是DL2000,之后从左往右依次的扩增条带本来应该是600多,1000多,500多。但是PCR(预变性94℃ 5min 30个循环94℃1min 55℃1min 72℃70s 之后72摄氏度7min)后电泳(2%的胶)出现很多非特异性扩增(只有600多那个出现了很浅很浅的特异性条带)。。。

1.没有出现目的条带,出现很多非特异性扩增,请问是引物的特异性问题吗?还是PCR温度的问题??
2.那个在点样孔边缘很细很亮的条带是什么啊??是不是RNA没提好导致cDNA出现了问题啊??

求助啊!cDNA扩增不出特异性条带!
2016_1_30 2016-01-30 13 时 36 分_副本.jpg
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Xie_Zijing

新虫 (初入文坛)

应该是引物的问题,建议重设引物

发自小木虫Android客户端
4楼2016-01-31 08:35:48
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新欣小生

银虫 (小有名气)

时间会证明一切
2楼2016-01-31 00:19:39
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 新欣小生 at 2016-01-31 00:19:39
跑的总RNA?

用cDNA跑的哈!
3楼2016-01-31 01:11:23
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Xie_Zijing

新虫 (初入文坛)

PCr非特异性条带过多也可适当调高退火温度

发自小木虫Android客户端
5楼2016-01-31 08:37:39
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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)

提高一下退火温度,比如60度或者更高,还有引物加的太多了,适当减少点

发自小木虫Android客户端
6楼2016-01-31 08:39:52
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by dragonhmw at 2016-01-31 08:39:52
提高一下退火温度,比如60度或者更高,还有引物加的太多了,适当减少点

我是用的10微升体系跑的,上游下游各0.4微升,cDNA0.4微升,这样的话引物还是多吗??

发自小木虫Android客户端
7楼2016-01-31 13:34:39
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dragonhmw

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by lixuxiao12 at 2016-01-31 13:34:39
我是用的10微升体系跑的,上游下游各0.4微升,cDNA0.4微升,这样的话引物还是多吗??
...

引物的浓度是10mM, 0.2微升引物就可以了
8楼2016-01-31 17:47:14
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lixuxiao12

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by dragonhmw at 2016-01-31 17:47:14
引物的浓度是10mM, 0.2微升引物就可以了...

这样啊  !我再跑跑看!
9楼2016-01-31 17:51:35
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jinghun2004

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lixuxiao12: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2016-02-02 12:13:58
反转cDNA前Total RNA  需要用DNase I消化一下;从电泳图看引物应当减少,另外1000bp以下目的片段延伸时间有40S就足够了 。
10楼2016-02-02 10:40:52
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