应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊！小白求救啊！
211/3返回列表123下一页
查看: 2819  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)

[求助] 用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊！小白求救啊！ 已有4人参与

要做HEK293表达一种GPCR，然后老板让我试试直接用挂着酶切微店的引物跑PCR，已经试了9次了，一直不成功。
引物： F： GCC 酶切位点 序列前端25bp
          R： 序列末端25bp 酶切位点 CCG

片段长是2078bp, ORF 1688bp
用的LA Taq.  PCR 程序试过很多种，推荐的2 step 和正常的3step， 还有各种退火温度都试过了。
也试过用PCR产物为模板再跑一次PCR了,就是看不到条带啊。
其中有一次看到条带了，结果小于1600bp.

已经耽误了好多天了，求救啊师兄师姐们，
研一的小白要疯掉了。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2016-01-25 09:55:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

leisure797

铁杆木虫 (职业作家)

百里登风

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
友情支持：高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu
赞一下 回复此楼
笑一个！
2楼2016-01-25 10:19:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王世玉

新虫 (初入文坛)
可以换一下酶试试
赞一下 回复此楼
3楼2016-01-25 10:47:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by leisure797 at 2016-01-25 10:19:31
友情支持：高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu

实验室都不用这些欸。下午换了KOD-plus酶，还是没有条带。TnT
赞一下 回复此楼
4楼2016-01-25 20:25:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

noblefire

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
gpcr是真核的基因，你用的模板是cDNA么？可能是模板的问题，因为用cDNA一般很容易扩增。你用的酶几乎是最好的了，虽然大材小用了。
实在不行先设计一段500bp的片段(介于你的酶比引物贵多了)，扩增一下看看模板有没有问题。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-01-25 21:08:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

noblefire

铁虫 (小有名气)
补充:你的R引物反向互补了么？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
6楼2016-01-25 21:10:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mlbiosci

新虫 (正式写手)
个人认为上下游引物tm值要保持一样，这是最重要的

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
7楼2016-01-25 23:46:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhufadi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的r引物出问题了，把酶切位点挂r引物的5,端吧，拿着引物问问实验室的师兄师姐们去吧！

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
世上无难事，只怕有心人！
8楼2016-01-25 23:51:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

buthey

金虫 (正式写手)
你上下游引物直接用的这段序列的前端和末端，然后加上了酶切位点么？   你的引物符合引物设计的规则不

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
9楼2016-01-26 00:21:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiangzz555

新虫 (小有名气)
温度梯度pcr试了吗

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
10楼2016-01-26 01:21:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Ritaaaaaa 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +3 布布和一二 2026-08-07 3/150 2026-08-07 15:09 by gltch
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +4 哈哈114477 2026-08-01 4/200 2026-08-07 14:39 by jgy194592
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +4 yang182083 2026-08-06 6/300 2026-08-07 12:43 by 虫友是什么虫
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +23 低垂的野花 2026-07-31 31/1550 2026-08-07 12:22 by speculiar
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 娱乐 +4 Tide man 2026-08-03 4/200 2026-08-04 11:51 by wgch518
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭