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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊！小白求救啊！
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)

[求助] 用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊！小白求救啊！ 已有4人参与

要做HEK293表达一种GPCR，然后老板让我试试直接用挂着酶切微店的引物跑PCR，已经试了9次了，一直不成功。
引物： F： GCC 酶切位点 序列前端25bp
          R： 序列末端25bp 酶切位点 CCG

片段长是2078bp, ORF 1688bp
用的LA Taq.  PCR 程序试过很多种，推荐的2 step 和正常的3step， 还有各种退火温度都试过了。
也试过用PCR产物为模板再跑一次PCR了,就是看不到条带啊。
其中有一次看到条带了，结果小于1600bp.

已经耽误了好多天了，求救啊师兄师姐们，
研一的小白要疯掉了。
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1楼 2016-01-25 09:55:20
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leisure797

铁杆木虫 (职业作家)

百里登风

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
友情支持：高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu
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笑一个！
2楼2016-01-25 10:19:31
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王世玉

新虫 (初入文坛)
可以换一下酶试试
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3楼2016-01-25 10:47:57
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by leisure797 at 2016-01-25 10:19:31
友情支持：高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu

实验室都不用这些欸。下午换了KOD-plus酶，还是没有条带。TnT
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4楼2016-01-25 20:25:09
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noblefire

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
gpcr是真核的基因，你用的模板是cDNA么？可能是模板的问题，因为用cDNA一般很容易扩增。你用的酶几乎是最好的了，虽然大材小用了。
实在不行先设计一段500bp的片段(介于你的酶比引物贵多了)，扩增一下看看模板有没有问题。

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5楼2016-01-25 21:08:20
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noblefire

铁虫 (小有名气)
补充:你的R引物反向互补了么？

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6楼2016-01-25 21:10:15
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
个人认为上下游引物tm值要保持一样，这是最重要的

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7楼2016-01-25 23:46:57
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zhufadi

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的r引物出问题了，把酶切位点挂r引物的5,端吧，拿着引物问问实验室的师兄师姐们去吧！

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世上无难事，只怕有心人！
8楼2016-01-25 23:51:44
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buthey

金虫 (正式写手)
你上下游引物直接用的这段序列的前端和末端，然后加上了酶切位点么？   你的引物符合引物设计的规则不

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9楼2016-01-26 00:21:25
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jiangzz555

新虫 (小有名气)
温度梯度pcr试了吗

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10楼2016-01-26 01:21:14
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