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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 打算在N端加His标签，求个人帮着看看引物设计~急啊
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 打算在N端加His标签，求个人帮着看看引物设计~急啊 已有4人参与

因为3‘端用的NotI，保护碱基和酶切位点都太长，再加上His标签引物长度都58了，所以打算把His标签挪到5’端上去。
  5‘端用EcoRI酶切位点，我的引物序列是AAG ACA TGC CCA AAG GTG AAG，21个
  EcoRI用CCG作保护碱基，GAATTC酶切位点，还得再加个起始密码子ATG，然后挂His标签CATCATCACCATCACCAT
  所以最后上游引物应该是5’-3’  CCGGAATTCATG CATCATCACCATCACCAT AAGACATGCCCAAAGGTGAAG=51个，所有的密码子都是正向写，不用反向互补的写。
  51个啊！
  如果我把真正的引物序列减短一些呢，减到18个左右行不行。或者求大家给点建议吧。
  还有N端如果加标签的话，据说会有不一定能表达完的蛋白，这样上柱子的时候，这些杂蛋白也会挂上去。但在C端就可以保证蛋白是表达完整的。
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1楼 2014-11-21 15:05:02
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ggyy0911(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:19:21
你先说说你用的什么载体？很多载体是可以直接在N 端加his标签的，在N 端加标签不需要你的序列再加起始密码子。
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2楼2014-11-22 00:19:55
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Look_2014

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ggyy0911(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-25 13:19:36
如果把his标签挂在N端的话，确实会出现可能表达不完整的情况…

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Look
3楼2014-11-22 00:34:53
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-11-22 00:19:55
你先说说你用的什么载体？很多载体是可以直接在N 端加his标签的，在N 端加标签不需要你的序列再加起始密码子。

打算用pPIC9k和pPICZA，Za的C端自带了不用设计的。9k昨天算了一下，如果加在C端，下游引物再把NotI保护碱基去了，Tm值居然到80了。我一直都在载体上切，倒是可以不用加保护碱基了。

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4楼2014-11-22 08:24:41
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Look_2014 at 2014-11-22 00:34:53
如果把his标签挂在N端的话，确实会出现可能表达不完整的情况…

昨天设计出来算了一下，标签在3端Tm值高，上下游引物温度差别也很大。看网上说Tm有不加附加序列算的，也有加的……我个人觉得既然从第二轮开始酶切位点也参与成链，就应该算上。之前做也算上了，确实能p出来。但求给个建议吧……

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5楼2014-11-22 08:35:29
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Look_2014

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-11-22 08:35:29
昨天设计出来算了一下，标签在3端Tm值高，上下游引物温度差别也很大。看网上说Tm有不加附加序列算的，也有加的……我个人觉得既然从第二轮开始酶切位点也参与成链，就应该算上。之前做也算上了，确实能p出来。但求 ...

我觉得参与成链的话应该算上，你既然能p出链来就先不要管网上怎么说，毕竟网上的也是他个人的见解，

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Look
6楼2014-11-22 19:25:47
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

载体有HIS 标签吧  不用自己引物设计时候加了
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7楼2014-11-25 08:27:33
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你可以试试Pet28载体，在多克隆位点的上游和下游都有His，你想留哪个就留哪个
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8楼2014-11-25 14:04:56
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by korchagin at 2014-11-25 14:04:56
你可以试试Pet28载体，在多克隆位点的上游和下游都有His，你想留哪个就留哪个

我必需用真核载体，原核载体不能正确糖基化，表达不出来。

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9楼2014-11-26 11:07:24
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