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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)

[求助] 用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊!小白求救啊! 已有4人参与

要做HEK293表达一种GPCR,然后老板让我试试直接用挂着酶切微店的引物跑PCR,已经试了9次了,一直不成功。
引物: F: GCC 酶切位点 序列前端25bp
          R: 序列末端25bp 酶切位点 CCG

片段长是2078bp, ORF 1688bp
用的LA Taq.  PCR 程序试过很多种,推荐的2 step 和正常的3step, 还有各种退火温度都试过了。
也试过用PCR产物为模板再跑一次PCR了,就是看不到条带啊。
其中有一次看到条带了,结果小于1600bp.

已经耽误了好多天了,求救啊师兄师姐们,
研一的小白要疯掉了。
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mlbiosci

新虫 (正式写手)

个人认为上下游引物tm值要保持一样,这是最重要的

发自小木虫Android客户端
7楼2016-01-25 23:46:57
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leisure797

铁杆木虫 (职业作家)

百里登风

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
友情支持:高保真的酶,takara 的pyrobest,Thermo的Phusion,还有FastPfu
笑一个!
2楼2016-01-25 10:19:31
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王世玉

新虫 (初入文坛)

可以换一下酶试试
3楼2016-01-25 10:47:57
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by leisure797 at 2016-01-25 10:19:31
友情支持:高保真的酶,takara 的pyrobest,Thermo的Phusion,还有FastPfu

实验室都不用这些欸。下午换了KOD-plus酶,还是没有条带。TnT
4楼2016-01-25 20:25:09
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