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用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊！小白求救啊！ 已有4人参与
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要做HEK293表达一种GPCR，然后老板让我试试直接用挂着酶切微店的引物跑PCR，已经试了9次了，一直不成功。 引物： F： GCC 酶切位点 序列前端25bp R： 序列末端25bp 酶切位点 CCG 片段长是2078bp, ORF 1688bp 用的LA Taq. PCR 程序试过很多种，推荐的2 step 和正常的3step， 还有各种退火温度都试过了。 也试过用PCR产物为模板再跑一次PCR了,就是看不到条带啊。 其中有一次看到条带了，结果小于1600bp. 已经耽误了好多天了，求救啊师兄师姐们， 研一的小白要疯掉了。 |
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3楼2016-01-25 10:47:57
leisure797
铁杆木虫 (职业作家)
百里登风
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2楼2016-01-25 10:19:31
4楼2016-01-25 20:25:09
noblefire
铁虫 (小有名气)
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- 专业: 有机合成
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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gpcr是真核的基因，你用的模板是cDNA么？可能是模板的问题，因为用cDNA一般很容易扩增。你用的酶几乎是最好的了，虽然大材小用了。 实在不行先设计一段500bp的片段(介于你的酶比引物贵多了)，扩增一下看看模板有没有问题。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-01-25 21:08:20
