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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用挂着酶切位点的引物跑PCR结果跑不出来啊！小白求救啊！
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xiangbchen

金虫 (正式写手)
反向引物有问题。

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11楼2016-01-26 01:25:55
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
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5楼: Originally posted by noblefire at 2016-01-25 21:08:20
gpcr是真核的基因，你用的模板是cDNA么？可能是模板的问题，因为用cDNA一般很容易扩增。你用的酶几乎是最好的了，虽然大材小用了。
实在不行先设计一段500bp的片段(介于你的酶比引物贵多了)，扩增一下看看模板有没有 ...

模板没问题，600的P出来了.....R引物肯定反向了- -
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12楼2016-01-26 09:56:34
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
SORRY 啊，没说清楚。我R引物是反向的....犯这个错误应该会被老板扔出去吧...
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13楼2016-01-26 09:57:54
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by zhufadi at 2016-01-25 23:51:44
你的r引物出问题了，把酶切位点挂r引物的5,端吧，拿着引物问问实验室的师兄师姐们去吧！

您好，现在酶切位点不就是靠近5‘端嘛，我问了师兄....引物没问题..
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14楼2016-01-26 10:02:47
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noblefire

铁虫 (小有名气)
实在不行就一段一段的扩增，最后用重组pcr融合。

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15楼2016-01-26 10:16:27
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by noblefire at 2016-01-26 10:16:27
实在不行就一段一段的扩增，最后用重组pcr融合。

TnT 大写的崩溃，我现在试试用KOD跑个梯度，昨天做的2step，今天试试3step吧。不行的话就一段一段P了。

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16楼2016-01-26 10:30:59
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懒猫633

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先找师兄师姐确定下引物有没有问题吧，引物Tm值相差太远，形成引物二聚体什么的，，，，先确定引物没问题了，再摸一摸温度和模板浓度梯度，多试一试，有的时候酶也是个影响因素，有的我用Primer Star 死活弄不出来，就是没条带，换个普通的Taq Mix，一次就出来了，多摸索一下。问问师兄师姐能省很多时间
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17楼2016-01-26 14:29:31
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by jiangzz555 at 2016-01-26 01:21:14
温度梯度pcr试了吗

试了。。。完全没条带。。。
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18楼2016-01-26 15:39:30
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Ritaaaaaa

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 懒猫633 at 2016-01-26 14:29:31
先找师兄师姐确定下引物有没有问题吧，引物Tm值相差太远，形成引物二聚体什么的，，，，先确定引物没问题了，再摸一摸温度和模板浓度梯度，多试一试，有的时候酶也是个影响因素，有的我用Primer Star 死活弄不出来， ...

引物给师兄师姐看了，温度和浓度梯度都试过了。并没有用。
FOR: 5’- GCC GAATTC TGCAGATGGCGCGGGAGGCCCGACT -3’
REV: 5’- GCC GAGCTC ATGTCTCCTGGCTTTCCCTGCATGT -3’
感觉会不是引物的Tm太高了，所以P不出来啊
在国外念书，有时候跟师兄师姐的沟通不是特别良好....实验室的气氛就是，有趣呀！试试看呢！  教授看到我出不来结果笑的比谁开心....
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19楼2016-01-26 16:27:56
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jiangzz555

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by Ritaaaaaa at 2016-01-26 15:39:30
试了。。。完全没条带。。。...

引物里面减几个碱基吧，先p出来东西再说，引物越长越难p
你确定引物没问题吗，换一家公司再合一对一样的
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20楼2016-01-26 18:54:45
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