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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » RACE-PCR已知序列的扩增
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[求助] RACE-PCR已知序列的扩增 已有2人参与

想做RACE-PCR，首先我想扩增已知序列，那么我设计引物是加酶切位点需要考虑什么呢？
普通PCR是根据想要连接的表达载体上的酶切位点来确定引物的酶切位点，这种RACE的怎么弄？跪求！！！
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1楼 2016-01-02 17:24:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by yuguiyan at 2016-01-04 09:13:32
"测序完拿测出的序列去设计后面的实验"
请问后面的实验中，我用到这段序列时，用的是含有序列的质粒吗？
这个质粒是与测序载体连在一起还是需要把测序载体切掉？...

拜托下次问问题讲清楚一点，我先不管你所讲的普通PCR，race到底怎么回事，我来告诉你怎么做吧，race是要扩增未知的序列，但此未知序列的一端相邻的序列知道一部分，就拿这部分已知序列设计一段引物，与race引物一起进行扩增，扩增出的序列或者连载体（当然T载体最方便）去测序或者不连载体直接测序（需提供引物给测序公司，但race引物量应该不够，也太浪费，不建议此法），测序后就知道扩增出的片段序列了，然后根据测出的序列设计引物进行后续实验，根据序列内部酶切位点和后续工作中用到的载体上的酶切位点（做后续工作中可能把片段要从一个载体切下来连到另一载体上，如果这样，要考虑所有要用到载体上的合适位点）确定要用到酶切位点，把酶切位点加到所设计引物上，再加上保护碱基，合成引物进行PCR得到此前未知目的片段。
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24楼2016-01-06 09:25:11
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
亲，你还没搞明白，是你先做RACE得到全部的序列，加酶切位点的话是需要专门设计引物的，而这两个是没有关联的，RACE引物和酶切位点的引物不一样，扩出来的产物也不一样，之后的用途也不一样，完全是两个方向
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
22楼2016-01-05 09:48:40
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
race为什么要加酶切位点？先race出来产物进行测序，用测出的精确序列再设计引物加酶切位点进行后续工作，否则序列里是否有你加的酶切位点都不知道做，往下可能会出很多问题
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6楼2016-01-03 00:14:54
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

做race就是为了得到序列测序，测序完拿测出的序列去设计后面的实验，测序载体只是为了方便用通用引物测序，跟你后续实验无关，你可以连在任意载体去测序，也可以直接拿race出的产物去测序
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17楼2016-01-04 01:57:03
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普通回帖

yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
2楼2016-01-02 18:22:17
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
3楼2016-01-02 18:30:04
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
4楼2016-01-02 19:55:15
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
5楼2016-01-02 22:55:47
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yguang at 2016-01-03 00:14:54
race为什么要加酶切位点？先race出来产物进行测序，用测出的精确序列再设计引物加酶切位点进行后续工作，否则序列里是否有你加的酶切位点都不知道做，往下可能会出很多问题

我先利用普通PCR将已知的一段序列扩增出来，此时我想测序，连接T载体，那么测完序，想要做RACE时，需要把T载体切下来吗？
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7楼2016-01-03 11:15:28
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匿名

用户注销 (正式写手)
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8楼2016-01-03 11:32:19
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 大-木-虫 at 2016-01-03 11:32:19
刚开始最好不要加酶切位点，做RACE无非是想知道序列，先得到你的序列再说。

我先利用普通PCR将已知的一段序列扩增出来，此时我想测序，连接T载体，

那么测完序，想要做RACE时，需要把T载体切下来吗？
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9楼2016-01-03 11:35:03
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
10楼2016-01-03 14:58:29
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