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realfio

金虫 (小有名气)

[求助] 请教一个关于RACE的问题

最近要做RACE,这几天看说明书的时候,忽然冒出一个想法:
有了total RNA模板,已知cDNA的一小段序列,那么——

设计引物,做反转录,不就直接得到此引物序列到cDNA3'的序列了?
mRNA 5' -------------------- 3'
cDNA 3' ----------XXXXX      5'

再设计引物,和Oligo(dT)一起做PCR,不就直接得到此引物序列到cDNA5'的序列了?
mRNA 5' --------------------AAAAA 3'
cDNA 3'           XXXXX-----TTTTT 5'

(XXXXX为已知序列,以此序列设计引物)

还做RACE干嘛呀??

[ Last edited by realfio on 2013-2-28 at 17:07 ]
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mascotte

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这么做RACE是可以的,最初做RACE的时候也是这么做的,当年我做RACE所使用的也是这种“序列特异的引物”,此外还用使用random primer和oligo dT引物的办法。需要注意的是不同的引物得到的5‘ UTR的序列会有区别,不同试剂盒采用不同原理得到的5’UTR的长短也会有不同。
2楼2013-02-28 19:23:05
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dzxy7678

铁虫 (小有名气)

楼主,你试了吗?你这种方法能做出来吗
3楼2013-03-13 09:14:25
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竹子小小

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

好吧,你的想法对了一半,但是,你需要PCR扩增后才能测序吧,不加个接头,PCR的另一条引物你要去哪里弄?
4楼2013-03-13 10:13:49
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jk_xdx

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

设计引物,做反转录,不就直接得到此引物序列到cDNA3'的序列了?
mRNA 5' -------------------- 3'
cDNA 3' ----------XXXXX      5'
问题:你怎么得到序列呢?不用PCR直接就能送测序么?

再设计引物,和Oligo(dT)一起做PCR,不就直接得到此引物序列到cDNA5'的序列了?
mRNA 5' --------------------AAAAA 3'
cDNA 3'           XXXXX-----TTTTT 5'
问题:你试过用oligo dT 做PCR么?
5楼2013-03-21 18:08:54
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