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RACE原理真诚求指教
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看了好几个版本的3`和5`RACE原理，还是很迷惑，求达人指点 还是搞不清楚几个问题， 1、所说的末端未知序列到底是那一段序列，比如说3`RACE，说是该末端有个ploy（A）尾巴，未知序列指的就是尾巴前面的一段序列？而mRNA通常不都是已知的吗，还扩增这末端？什么情况下未知呢？ 2、下图所诉原理，中搞不懂为什么设计最上面那3个锚定引物，有的地方称内外侧引物，若说上面我描述的未知末端位置是对的，那下面图中一直用一个基因特异性引物和一个锚定引物进行几轮PCR，不可以吗？ 3、5`末端指哪里呢，原理也不清楚呀？  未命名.jpg [ Last edited by qwky2010 on 2013-3-6 at 11:07 ] |
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niil
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【答案】应助回帖
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qwky2010: 金币+10, ★★★★★最佳答案, 真诚感激您细心讲解， 2013-03-06 13:20:43
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关于RACE的方法，是有来历的。在很多的实验里面，比如cDNA文库的构建、同源克隆等，获得的cDNA片段通常都是部分的，而cDNA的两个末端是未知的，也就是5'末端和3'末端，末端难以克隆是因为PCR技术的局限性，PCR要克隆一个片段，必须是片段两端已知，才能设计引物，然后进行克隆。而cDNA末端是未知的，所以有一条引物是不能设计的，这样就不能很方便的克隆全长cDNA，也许RACE技术就相应诞生了。所有的RACE的原理不外乎是把未知末端变成已知末端，然后就可以用PCR的技术克隆出来了。包括楼主图示的原理，就是加了已知接头，在接头上设计引物，和内部已知序列上的基因特异引物配对就完成了克隆。此外还有其他技术，如反向PCR，SMART RACE等。 看你的图示原理，没有详细的文字说明比较难懂。尤其是图上的“第一链扩增”“第二链扩增”这种称谓感觉不妥。写成“第一次PCR”和“第二次PCR”感觉还行。 你的图示原理是利用反转录过程中加接头的方式，然后通过巢式PCR来进行的RACE，巢式PCR可以提高RACE的成功率。 A图是设计的接头，接头名字叫QT，它不是很长，估计也就60-70bp吧，中间涉及上了酶切位点，便于后续操作，QT的3'端是多聚T,在QT上游设计了两个引物：Q0和Q1，Q0是外侧引物，Q1是内侧引物，分别用于巢式PCR的第一次和第二次PCR扩增。 B图，是3' RACE应该比较好理解。使用QT为反转录引物直接进行反转录，因为QT的3端是多聚T，所以可以和mRNA的3'的polyA结合，这样反转录后cDNA的3'末端就加上了QT接头，然后根据特异基因序列设计基因特异性引物GSP1和GSP2，Q0和GSP1进行第一次PCR，Q1和QGSP2进行第二次PCR，最终能够获得3 RACE产物。该方法具有通用性，而且成功率很高。 C图 是5'RACE原理，稍微复杂一点，根据基因序列设计GSP-RT引物为反转录引物，使用它可以把目标基因反转录出来得到cDNA，但是因为没有多聚A，所以不能加上QT接头。图中加入了一步cDNA加尾目的就是能够利用QT，加尾之后，第一次PCR（也就是第一链扩增）使用QT和Q0与GSP1三条引物共同进行扩增，这样就变相的把QT加到了cDNA的5'末端。然后用Q1和GSP2进行第二次PCR，最后能获得5 RACE产物。值得注意的是，针对同一个基因，B图中的GSP1和GSP2与C图中的GSP1和GSP2是不一样的，需要分别设计。 此外，这个原理中的5'RACE虽然有针对性，但它是麻烦的，麻烦在于每个基因需要多设计一条基因特异性的反转录引物GSP-RT，因此反转录产物没有通用性。现在可能多用基于SMART技术的RACE方法，比较便利。 |
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qwky20102楼2013-03-06 12:28:23
3楼2013-03-06 13:21:13