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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » RACE-PCR已知序列的扩增
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
16楼: Originally posted by junior850621 at 2016-01-04 00:11:17
测序完了为什么还要切T载体？

我首先扩增这段已知序列，设计引物时需不需要加酶切位点呢？
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21楼2016-01-04 09:19:53
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
亲，你还没搞明白，是你先做RACE得到全部的序列，加酶切位点的话是需要专门设计引物的，而这两个是没有关联的，RACE引物和酶切位点的引物不一样，扩出来的产物也不一样，之后的用途也不一样，完全是两个方向
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
22楼2016-01-05 09:48:40
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 曼陀罗的祈祷 at 2016-01-05 09:48:40
亲，你还没搞明白，是你先做RACE得到全部的序列，加酶切位点的话是需要专门设计引物的，而这两个是没有关联的，RACE引物和酶切位点的引物不一样，扩出来的产物也不一样，之后的用途也不一样，完全是两个方向

我说的是扩增已知的那段序列，需要加酶切位点吗？
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23楼2016-01-05 23:05:01
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yguang

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by yuguiyan at 2016-01-04 09:13:32
"测序完拿测出的序列去设计后面的实验"
请问后面的实验中，我用到这段序列时，用的是含有序列的质粒吗？
这个质粒是与测序载体连在一起还是需要把测序载体切掉？...

拜托下次问问题讲清楚一点，我先不管你所讲的普通PCR，race到底怎么回事，我来告诉你怎么做吧，race是要扩增未知的序列，但此未知序列的一端相邻的序列知道一部分，就拿这部分已知序列设计一段引物，与race引物一起进行扩增，扩增出的序列或者连载体（当然T载体最方便）去测序或者不连载体直接测序（需提供引物给测序公司，但race引物量应该不够，也太浪费，不建议此法），测序后就知道扩增出的片段序列了，然后根据测出的序列设计引物进行后续实验，根据序列内部酶切位点和后续工作中用到的载体上的酶切位点（做后续工作中可能把片段要从一个载体切下来连到另一载体上，如果这样，要考虑所有要用到载体上的合适位点）确定要用到酶切位点，把酶切位点加到所设计引物上，再加上保护碱基，合成引物进行PCR得到此前未知目的片段。
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24楼2016-01-06 09:25:11
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by yuguiyan at 2016-01-05 23:05:01
我说的是扩增已知的那段序列，需要加酶切位点吗？...

你既然要对已知序列扩增，为什么要加酶切位点呢？
加酶切位点就是为了之后用酶把那段基因切下来才需要加，你既然不需要做这个，为什么要加酶切位点呢？也没用啊
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
25楼2016-01-06 11:33:30
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by yguang at 2016-01-06 09:25:11
拜托下次问问题讲清楚一点，我先不管你所讲的普通PCR，race到底怎么回事，我来告诉你怎么做吧，race是要扩增未知的序列，但此未知序列的一端相邻的序列知道一部分，就拿这部分已知序列设计一段引物，与race引物一起 ...

解释的很清楚，感觉楼主把RACE和后面载体构建搞混了
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
26楼2016-01-06 11:35:07
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
24楼: Originally posted by yguang at 2016-01-06 09:25:11
拜托下次问问题讲清楚一点，我先不管你所讲的普通PCR，race到底怎么回事，我来告诉你怎么做吧，race是要扩增未知的序列，但此未知序列的一端相邻的序列知道一部分，就拿这部分已知序列设计一段引物，与race引物一起 ...

已知序列扩增时，无需加酶切位点，对吗？
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27楼2016-01-08 15:27:19
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
28楼2016-01-12 11:04:29
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
29楼2016-01-15 23:56:02
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
30楼2016-01-16 13:23:37
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