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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 质粒单酶切，通过电泳能否知道酶切是否充分
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tianyufeiyu

铁虫 (初入文坛)

[求助] 质粒单酶切，通过电泳能否知道酶切是否充分 已有3人参与

我用EcoRV酶切pCDNA3.1/V5-HisB,我想知道酶切的是否充分，还请各位大神不吝赐教，谢谢啦
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1楼 2015-12-28 16:57:53
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gyesang

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4楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-29 21:24:32
做一个转化，线性质粒一般转不进细菌里，若正常转化一个转化子都没有，则酶切基本完全。...

“线性质粒一般转不进细菌里”，你这个说法不对，线性质粒照样可以转进细菌感受态细胞，如果单酶切后没有进行去磷酸化处理，细菌会将其修复，从而质粒可以在细菌细胞内复制，如果进行了去磷酸化处理，线性DNA不能被修复成环状，从而不能复制
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11楼2015-12-31 10:56:28
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gyesang

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8楼: Originally posted by szlylk0105 at 2015-12-31 10:26:32
质粒有3种存在形态，环形、半环、线形。而这三种形态的质粒在琼脂糖凝胶电泳中的运动速度不一样，为环形>半环>线形。所以线性化后的质粒要比之前跑的慢，也就是分子量大。

“所以线性化后的质粒要比之前跑的慢，也就是分子量大”，这句话不对，无论是你说的环形，半环，线形质粒DNA（你这里的术语也不专业），它们的分子量是一样大，因为碱基数还是一样，不同的是cccDNA, ocDNA, linear DNA它们的空间构象不一样，所以共价闭合环状DNA的泳动速度大于线性DNA大于开环DNA，开环DNA跑得最慢
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9楼2015-12-31 10:52:36
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tianyufeiyu: 金币+3 2016-01-14 16:22:04
tianyufeiyu: 金币+2 2016-01-14 16:24:55
线性质粒一般要比超螺旋质粒跑得慢，如果酶切后电泳只有一条带就应该是酶切充分了，跑得时间要长一点，最好加个未酶切的作对照。
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生物科学
2楼2015-12-28 19:27:59
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tianyufeiyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-28 19:27:59
线性质粒一般要比超螺旋质粒跑得慢，如果酶切后电泳只有一条带就应该是酶切充分了，跑得时间要长一点，最好加个未酶切的作对照。

也就是说电泳是可以看到酶切的效果，请问你还知不知道有其他的方法
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3楼2015-12-29 11:06:00
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科学小覃

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tianyufeiyu at 2015-12-29 11:06:00
也就是说电泳是可以看到酶切的效果，请问你还知不知道有其他的方法...

做一个转化，线性质粒一般转不进细菌里，若正常转化一个转化子都没有，则酶切基本完全。
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生物科学
4楼2015-12-29 21:24:32
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tianyufeiyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-28 19:27:59
线性质粒一般要比超螺旋质粒跑得慢，如果酶切后电泳只有一条带就应该是酶切充分了，跑得时间要长一点，最好加个未酶切的作对照。

谢谢
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5楼2015-12-30 11:22:36
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tianyufeiyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-29 21:24:32
做一个转化，线性质粒一般转不进细菌里，若正常转化一个转化子都没有，则酶切基本完全。...

这是我的酶切后的电泳图，第1个孔是没酶切的质粒，2-4孔是酶切后的，请你帮我分析下，酶切的怎么样
质粒单酶切，通过电泳能否知道酶切是否充分
]EX5{3QW~YV1Y7VZ`IPUTLF.png
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6楼2015-12-30 11:26:11
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科学小覃

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tianyufeiyu at 2015-12-30 11:26:11
这是我的酶切后的电泳图，第1个孔是没酶切的质粒，2-4孔是酶切后的，请你帮我分析下，酶切的怎么样

]EX5{3QW~YV1Y7VZ`IPUTLF.png
...

应该没问题了
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生物科学
7楼2015-12-30 16:03:03
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szlylk0105

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒有3种存在形态，环形、半环、线形。而这三种形态的质粒在琼脂糖凝胶电泳中的运动速度不一样，为环形>半环>线形。所以线性化后的质粒要比之前跑的慢，也就是分子量大。
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8楼2015-12-31 10:26:32
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tianyufeiyu

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-30 16:03:03
应该没问题了...

谢谢
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10楼2015-12-31 10:55:16
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