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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » RT-PCR引物求助
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xiximary

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR引物求助已有1人参与

我做RT-PCR时，参照基因特异性很好，就是目的基因总有一条非特异性条带，重新设计引物，调退火温度怎么也去除不了。看网上说要横跨内含子，不知怎么找基因的内含子和外显子？我是在NCBI上找到基因的序列设计的引物，这里是mRNA，应该没有内含子。我看网上报道RT-PCR产物片段最好在200bp以内。我是新手，请问该怎么设计这种引物才能成功？还有好多不懂的东西，望各位专家赐教，非常感谢。
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1楼2015-12-20 22:24:56
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xiximary

铁杆木虫 (正式写手)
gnot_nail您好：我设计引物时是在NCBI网上查到的mRNA序列设计的引物，由于目的基因扩增有一条小的非特异条带，怎么改变条件也去除不了。看网上说要横跨内含子，不知怎么找基因的内含子和外显子？请问该怎么设计这种引物才能成功？谢谢您。
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3楼2015-12-21 20:14:47
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
简单说，就是你拿cDNA序列来设计引物，然后会有一个产物的大小，大约80-200bp，然后你还需要DNA序列的信息，当你把设计的引物放到DNA序列中查找时（借助相关软件比如vector nti），会得到你这对引物在DNA中的距离大小，如果在DNA中的片段比在cDNA中的片段要大，那么就横跨内含子了。
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2楼2015-12-21 18:28:36
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