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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR求助
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dreamshaker

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR求助

各位大虾：
    新手上路，请指教啊。最近做RT-PCR，内参已经调的差不多了，开始扩目的条带了，但是结果却不尽人意，很是焦急啊。主要难题就是扩出的条带弱，而且有引物二聚体的存在，重复性差。我说的在详细一些，目的条带是300-500bp左右，我用的是退火温度是55度，35cycles。是不是是退火温度的原因？还有啊，引物单子上对的Tm值有两个Tm（1MNa）和Tm（0.05M Na）时的，我应该用那一个啊，如何设计引物的退火温度啊 ，请各位不吝赐教啊，将很感激啊。
    再附上劣图一张，以图为参考给出些意见啊。
    对于图片再做些说明，上下两个目的基因，有点marker（DL2000），5个挨紧的条带是目的条带的不同时间处理，就跑成这个样子了啊，惭愧啊，请各位给点意见。
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踏踏实实，体会科研的乐趣
1楼 2011-11-24 11:57:00
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-24 18:22:10
dreamshaker(金币+1): 关于Tm值我有一些了解了，谢谢。 2011-11-25 12:36:48
引物单子上Tm(1MNa)代表作杂交时的温度，Tm(0.05MNa）代表的是PCR时的温度。要做PCR可以按照后一个，一般所示的Tm值都偏低，可以按照自己用软件设计的Tm-（5-10度）来进行PCR 。
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hehe
2楼2011-11-24 13:50:26
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cjzyfx

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-11-24 21:25:54
RT-pcr 忌讳有引物二聚体，建议楼主还是跟换引物，因为引物二聚体跟退火温度关系不是太大！
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迷茫的蚊子
3楼2011-11-24 13:56:38
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助！Real-time PCR的成本要高很多，所以很多人会做半定量（普通PCR，跑胶比较条带亮度），不需要专门仪器和耗材，循环数调合适就可以了。 2011-11-24 21:30:00
楼主的结果是要定量吗？比较不同处理时间的RNA水平变化吗？如果是的话，建议直接做REAL TIME PCR
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jiayoubashaonian
4楼2011-11-24 19:20:22
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！看楼主的图似乎是做半定量，直接普通的PCR比较条带亮度呢。不过，有二聚体确实是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金币+4): 谢谢你的建议！ 2011-11-25 12:36:14
退火温度直接引用你引物软件设计上的温度，引物单上的温度不一定正确，你的片段貌似长了点，一般在150到200比较好，有引物二聚体应该是你的引物质量不是很好，如果有时间还是重新设计一对吧，这个对你后面的实验非常的重要，另外你可以现在普通上PCR试验一下，摸索合适的温度再放到定量PCR上，你说你的重复性不是很好，根据我的经验有两个原因，一个是你的基因如果是低表达的，你可以适当增加模板浓度，另外就是你在加样的时候操作不一致，不连贯，建议在加样的时候先写好一个单子，具体到每个样加多少，加的顺序是什么样的，尽量在实验的时候别临时思考。
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5楼2011-11-24 21:04:46
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dreamshaker

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-24 19:20:22:
楼主的结果是要定量吗？比较不同处理时间的RNA水平变化吗？如果是的话，建议直接做REAL TIME PCR

我是做的半定量，不过我已经用内参基因把cDNA模板调到一致了，现在是扩目的条带呢。
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踏踏实实，体会科研的乐趣
6楼2011-11-24 22:01:48
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dreamshaker

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 保护你的大树 at 2011-11-24 21:04:46:
退火温度直接引用你引物软件设计上的温度，引物单上的温度不一定正确，你的片段貌似长了点，一般在150到200比较好，有引物二聚体应该是你的引物质量不是很好，如果有时间还是重新设计一对吧，这个对你后面的实验非 ...

嗯，你说的很对，我就是在筛诱导表达的基因，是地表达的 ，谢谢你的建议。
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踏踏实实，体会科研的乐趣
7楼2011-11-24 22:06:20
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xan36

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-11-25 16:13:54
如果条件允许的话，建议楼主设个温度梯度摸个最适合的温度条件
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风雨后的阳光更珍贵
8楼2011-11-25 12:12:57
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
目的条带扩增得出来，差异也很明显，这个半定量摸索得差不多了

可以尝试提高退火温度以提高特异性，比如58℃。试试即可，如果没看到改善，就重新设计引物吧，这样子比摸索退火温度更省事省力。
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9楼2011-11-25 16:17:40
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