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dreamshaker铜虫 (正式写手)
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RT-PCR求助
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各位大虾： 新手上路，请指教啊。最近做RT-PCR，内参已经调的差不多了，开始扩目的条带了，但是结果却不尽人意，很是焦急啊。主要难题就是扩出的条带弱，而且有引物二聚体的存在，重复性差。我说的在详细一些，目的条带是300-500bp左右，我用的是退火温度是55度，35cycles。是不是是退火温度的原因？还有啊，引物单子上对的Tm值有两个Tm（1MNa）和Tm（0.05M Na）时的，我应该用那一个啊，如何设计引物的退火温度啊 ，请各位不吝赐教啊，将很感激啊。 再附上劣图一张，以图为参考给出些意见啊。 对于图片再做些说明，上下两个目的基因，有点marker（DL2000），5个挨紧的条带是目的条带的不同时间处理，就跑成这个样子了啊，惭愧啊，请各位给点意见。  |
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2楼2011-11-24 13:50:26
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3楼2011-11-24 13:56:38
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4楼2011-11-24 19:20:22
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！看楼主的图似乎是做半定量，直接普通的PCR比较条带亮度呢。不过，有二聚体确实是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金币+4): 谢谢你的建议！ 2011-11-25 12:36:14
西瓜(金币+5): Good！看楼主的图似乎是做半定量，直接普通的PCR比较条带亮度呢。不过，有二聚体确实是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金币+4): 谢谢你的建议！ 2011-11-25 12:36:14
| 退火温度直接引用你引物软件设计上的温度，引物单上的温度不一定正确，你的片段貌似长了点，一般在150到200比较好，有引物二聚体应该是你的引物质量不是很好，如果有时间还是重新设计一对吧，这个对你后面的实验非常的重要，另外你可以现在普通上PCR试验一下，摸索合适的温度再放到定量PCR上，你说你的重复性不是很好，根据我的经验有两个原因，一个是你的基因如果是低表达的，你可以适当增加模板浓度，另外就是你在加样的时候操作不一致，不连贯，建议在加样的时候先写好一个单子，具体到每个样加多少，加的顺序是什么样的，尽量在实验的时候别临时思考。 |
5楼2011-11-24 21:04:46
dreamshaker
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