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dreamshaker

铜虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR求助

各位大虾:
    新手上路,请指教啊。最近做RT-PCR,内参已经调的差不多了,开始扩目的条带了,但是结果却不尽人意,很是焦急啊。主要难题就是扩出的条带弱,而且有引物二聚体的存在,重复性差。我说的在详细一些,目的条带是300-500bp左右,我用的是退火温度是55度,35cycles。是不是是退火温度的原因?还有啊,引物单子上对的Tm值有两个Tm(1MNa)和Tm(0.05M Na)时的,我应该用那一个啊,如何设计引物的退火温度啊 ,请各位不吝赐教啊,将很感激啊。
    再附上劣图一张,以图为参考给出些意见啊。
    对于图片再做些说明,上下两个目的基因,有点marker(DL2000),5个挨紧的条带是目的条带的不同时间处理,就跑成这个样子了啊,惭愧啊,请各位给点意见。
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

目的条带扩增得出来,差异也很明显,这个半定量摸索得差不多了

可以尝试提高退火温度以提高特异性,比如58℃。试试即可,如果没看到改善,就重新设计引物吧,这样子比摸索退火温度更省事省力。
9楼2011-11-25 16:17:40
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-24 18:22:10
dreamshaker(金币+1): 关于Tm值我有一些了解了,谢谢。 2011-11-25 12:36:48
引物单子上Tm(1MNa)代表作杂交时的温度,Tm(0.05MNa)代表的是PCR时的温度。要做PCR可以按照后一个,一般所示的Tm值都偏低,可以按照自己用软件设计的Tm-(5-10度)来进行PCR 。
hehe
2楼2011-11-24 13:50:26
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cjzyfx

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-11-24 21:25:54
RT-pcr 忌讳有引物二聚体,建议楼主还是跟换引物,因为引物二聚体跟退火温度关系不是太大!
迷茫的蚊子
3楼2011-11-24 13:56:38
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励应助!Real-time PCR的成本要高很多,所以很多人会做半定量(普通PCR,跑胶比较条带亮度),不需要专门仪器和耗材,循环数调合适就可以了。 2011-11-24 21:30:00
楼主的结果是要定量吗?比较不同处理时间的RNA水平变化吗?如果是的话,建议直接做REAL TIME PCR
jiayoubashaonian
4楼2011-11-24 19:20:22
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