| 查看: 958 | 回复: 8 | |||
dreamshaker铜虫 (正式写手)
|
[求助]
RT-PCR求助
|
|
各位大虾： 新手上路，请指教啊。最近做RT-PCR，内参已经调的差不多了，开始扩目的条带了，但是结果却不尽人意，很是焦急啊。主要难题就是扩出的条带弱，而且有引物二聚体的存在，重复性差。我说的在详细一些，目的条带是300-500bp左右，我用的是退火温度是55度，35cycles。是不是是退火温度的原因？还有啊，引物单子上对的Tm值有两个Tm（1MNa）和Tm（0.05M Na）时的，我应该用那一个啊，如何设计引物的退火温度啊 ，请各位不吝赐教啊，将很感激啊。 再附上劣图一张，以图为参考给出些意见啊。 对于图片再做些说明，上下两个目的基因，有点marker（DL2000），5个挨紧的条带是目的条带的不同时间处理，就跑成这个样子了啊，惭愧啊，请各位给点意见。  |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有51人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
lvbobo823
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 363 (硕士)
- 金币: 7753.3
- 散金: 15
- 红花: 9
- 帖子: 751
- 在线: 189.4小时
- 虫号: 819723
- 注册: 2009-07-31
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
2楼2011-11-24 13:50:26
cjzyfx
木虫 (正式写手)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 1927.1
- 散金: 181
- 红花: 2
- 帖子: 629
- 在线: 363.2小时
- 虫号: 657903
- 注册: 2008-11-19
- 性别: GG
- 专业: 作物分子育种
3楼2011-11-24 13:56:38
blackrose8089
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 16
- 应助: 100 (初中生)
- 贵宾: 0.11
- 金币: 10639.6
- 散金: 155
- 红花: 30
- 沙发: 6
- 帖子: 3703
- 在线: 790.4小时
- 虫号: 614948
- 注册: 2008-09-28
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
4楼2011-11-24 19:20:22
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): Good！看楼主的图似乎是做半定量，直接普通的PCR比较条带亮度呢。不过，有二聚体确实是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金币+4): 谢谢你的建议！ 2011-11-25 12:36:14
西瓜(金币+5): Good！看楼主的图似乎是做半定量，直接普通的PCR比较条带亮度呢。不过，有二聚体确实是不行的。 2011-11-24 21:31:20
dreamshaker(金币+4): 谢谢你的建议！ 2011-11-25 12:36:14
| 退火温度直接引用你引物软件设计上的温度，引物单上的温度不一定正确，你的片段貌似长了点，一般在150到200比较好，有引物二聚体应该是你的引物质量不是很好，如果有时间还是重新设计一对吧，这个对你后面的实验非常的重要，另外你可以现在普通上PCR试验一下，摸索合适的温度再放到定量PCR上，你说你的重复性不是很好，根据我的经验有两个原因，一个是你的基因如果是低表达的，你可以适当增加模板浓度，另外就是你在加样的时候操作不一致，不连贯，建议在加样的时候先写好一个单子，具体到每个样加多少，加的顺序是什么样的，尽量在实验的时候别临时思考。 |
5楼2011-11-24 21:04:46
dreamshaker
铜虫 (正式写手)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 25.5
- 散金: 11
- 红花: 3
- 帖子: 319
- 在线: 153.4小时
- 虫号: 1164834
- 注册: 2010-12-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
6楼2011-11-24 22:01:48
dreamshaker
铜虫 (正式写手)
- 应助: 6 (幼儿园)
- 金币: 25.5
- 散金: 11
- 红花: 3
- 帖子: 319
- 在线: 153.4小时
- 虫号: 1164834
- 注册: 2010-12-07
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
7楼2011-11-24 22:06:20
8楼2011-11-25 12:12:57
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
9楼2011-11-25 16:17:40
