| 查看: 587 | 回复: 5 | ||
[求助]
RT-PCR求助
|
|
本人近期做RT-PCR克隆基因，开始用p出来，可是目的条带很淡，后来优化体系，结果不但p不出来，还有很严重的拖尾现象（之前一直是形成引物二聚体），阴性对照也是如此。再返回到最初体系也p不出来了。 引物二聚体好理解因为做表达质粒，设计引物没办法只能这样，设计时提示引物二聚体就很多。可现在怎么p不出来，还拖尾这么严重。 pcr体系： 25ul pcr体系为: 水18ul、 10*buffer 2.5ul、 dNTPs 1ul、（10mM/each） 上下游引物各1ul（浓度10uM），后减为0.5ul 模板1ul(浓度200~300ng/ul左右)后减为0.5ul 酶pfu0.5ul（5U/ul） Pcr反应条件为：设置梯度延伸3min，后延长为4min。目的基因长度1800bp。  左边6孔为克隆目的基因，右边两孔为加水的阴性对照。  a最初pcr图：左边8孔为p我的目的基因，其中左1-4为pfu酶的，左5-8为taq酶的 DMSO,甘油，Mg都试过p不出我的目的基因，后来就出现如上图所示的拖尾现象了，请教各位高人，拖尾怎么解决，我可以怎么优化。 [ Last edited by wcx蜗牛 on 2012-5-3 at 11:26 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种?
已经有5人回复
-
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有227人回复
-
求助 食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社 电子版
已经有5人回复
-
胶体几丁质的结晶度？
已经有0人回复
-
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士
已经有2人回复
-
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线
已经有5人回复
2楼2012-05-03 18:03:31
3楼2012-05-03 18:53:20
4楼2012-05-04 14:15:12
liangxiuyan
木虫 (职业作家)
- 应助: 14 (小学生)
- 金币: 1873.5
- 帖子: 3304
- 在线: 134.5小时
- 虫号: 1132188
- 注册: 2010-10-26
- 专业: 兽医免疫学
5楼2012-05-04 14:49:31
6楼2012-05-05 10:28:48