应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR求助
61/1返回列表
查看: 843  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR求助

本人近期做RT-PCR克隆基因，开始用p出来，可是目的条带很淡，后来优化体系，结果不但p不出来，还有很严重的拖尾现象（之前一直是形成引物二聚体），阴性对照也是如此。再返回到最初体系也p不出来了。
引物二聚体好理解因为做表达质粒，设计引物没办法只能这样，设计时提示引物二聚体就很多。可现在怎么p不出来，还拖尾这么严重。
pcr体系：
25ul pcr体系为:   
水18ul、
10*buffer 2.5ul、
dNTPs 1ul、（10mM/each）
上下游引物各1ul（浓度10uM），后减为0.5ul
模板1ul(浓度200~300ng/ul左右)后减为0.5ul
酶pfu0.5ul（5U/ul）
Pcr反应条件为：设置梯度延伸3min，后延长为4min。目的基因长度1800bp。

左边6孔为克隆目的基因，右边两孔为加水的阴性对照。

a最初pcr图：左边8孔为p我的目的基因，其中左1-4为pfu酶的，左5-8为taq酶的

DMSO,甘油，Mg都试过p不出我的目的基因，后来就出现如上图所示的拖尾现象了，请教各位高人，拖尾怎么解决，我可以怎么优化。

[ Last edited by wcx蜗牛 on 2012-5-3 at 11:26 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2012-05-03 11:14:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来生物医药区 2012-05-03 18:09:18
你的这种情况我也碰见过，Pfu酶扩增的效果不如TAQ酶，如果TAQ酶能扩增，个人建议还是用TAQ酶扩增好些。你的片段1800，一般我会延伸10min。另外你做多少个循环,回到你最初的反应体系和程序，用梯度PCR仪做个梯度扩增，如果得到了目的片段，即使很不清楚，胶回收二次PCR，个人的一些经验。
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-03 18:03:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 双鱼猫咪 at 2012-05-03 18:03:31:
你的这种情况我也碰见过，Pfu酶扩增的效果不如TAQ酶，如果TAQ酶能扩增，个人建议还是用TAQ酶扩增好些。你的片段1800，一般我会延伸10min。另外你做多少个循环,回到你最初的反应体系和程序，用梯度PCR仪做个梯度扩 ...

谢谢你的回复。TAQ我们实验室的几个人用都突变，我构建表达质粒不敢用。另外TAQ的延伸速度不是可以达到1Kb/min，延伸10min有点长吧。现在问题是回到最初的反应体系和程序不是P不出来就是很严重的拖尾。
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-03 18:53:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-05-05 10:27:38
wcx蜗牛: 金币+2 2012-05-05 10:29:32
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-05 13:37:21
所有的试剂、体系都按之前能P出来的条件，一个用普通的你原来用的PCR仪，另一个用梯度PCR仪，在你原来退火温度上下加减5度，看看能不能P出来。我以前也是按原来的体系、条件发现P不出来，就是用梯度重新摸索的。体系中任何一个试剂的改变都可能有影响，试试看吧，祝你好运
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-04 14:15:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liangxiuyan

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wcx蜗牛: 金币+3 2012-05-05 10:28:54
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-05 13:37:30
首先建议你提高你的退火温度。然后是检查一下你的TAE电泳液，如果没什么问题。建议你重新提取RNA，做反转录，可以换一批试剂。
赞一下 回复此楼
每一段路途，都是为了成就一段梦想
5楼2012-05-04 14:49:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liangxiuyan at 2012-05-04 14:49:31:
首先建议你提高你的退火温度。然后是检查一下你的TAE电泳液，如果没什么问题。建议你重新提取RNA，做反转录，可以换一批试剂。

TAE别人用都还可以的，模板有时用TAQ酶能p出来，可换pfu就不行了
赞一下 回复此楼
6楼2012-05-05 10:28:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wcx蜗牛 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:33 by 4qO8zhfjr2AX
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 3/150 2026-08-29 21:32 by 4qO8zhfjr2AX
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 6/300 2026-08-29 21:22 by 4qO8zhfjr2AX
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 gy1nBQXYQJqL 2026-08-29 5/250 2026-08-29 21:11 by 4qO8zhfjr2AX
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +5 gdd2018 2026-08-28 10/500 2026-08-29 14:10 by Jacob678
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 14:03 by jCd0dEvKHShX
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 11:49 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 9/450 2026-08-29 09:59 by jklily
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭