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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR求助
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR求助

本人近期做RT-PCR克隆基因，开始用p出来，可是目的条带很淡，后来优化体系，结果不但p不出来，还有很严重的拖尾现象（之前一直是形成引物二聚体），阴性对照也是如此。再返回到最初体系也p不出来了。
引物二聚体好理解因为做表达质粒，设计引物没办法只能这样，设计时提示引物二聚体就很多。可现在怎么p不出来，还拖尾这么严重。
pcr体系：
25ul pcr体系为:   
水18ul、
10*buffer 2.5ul、
dNTPs 1ul、（10mM/each）
上下游引物各1ul（浓度10uM），后减为0.5ul
模板1ul(浓度200~300ng/ul左右)后减为0.5ul
酶pfu0.5ul（5U/ul）
Pcr反应条件为：设置梯度延伸3min，后延长为4min。目的基因长度1800bp。

左边6孔为克隆目的基因，右边两孔为加水的阴性对照。

a最初pcr图：左边8孔为p我的目的基因，其中左1-4为pfu酶的，左5-8为taq酶的

DMSO,甘油，Mg都试过p不出我的目的基因，后来就出现如上图所示的拖尾现象了，请教各位高人，拖尾怎么解决，我可以怎么优化。

[ Last edited by wcx蜗牛 on 2012-5-3 at 11:26 ]
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1楼 2012-05-03 11:14:42
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liangxiuyan at 2012-05-04 14:49:31:
首先建议你提高你的退火温度。然后是检查一下你的TAE电泳液，如果没什么问题。建议你重新提取RNA，做反转录，可以换一批试剂。

TAE别人用都还可以的，模板有时用TAQ酶能p出来，可换pfu就不行了
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6楼2012-05-05 10:28:48
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双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来生物医药区 2012-05-03 18:09:18
你的这种情况我也碰见过，Pfu酶扩增的效果不如TAQ酶，如果TAQ酶能扩增，个人建议还是用TAQ酶扩增好些。你的片段1800，一般我会延伸10min。另外你做多少个循环,回到你最初的反应体系和程序，用梯度PCR仪做个梯度扩增，如果得到了目的片段，即使很不清楚，胶回收二次PCR，个人的一些经验。
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2楼2012-05-03 18:03:31
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 双鱼猫咪 at 2012-05-03 18:03:31:
你的这种情况我也碰见过，Pfu酶扩增的效果不如TAQ酶，如果TAQ酶能扩增，个人建议还是用TAQ酶扩增好些。你的片段1800，一般我会延伸10min。另外你做多少个循环,回到你最初的反应体系和程序，用梯度PCR仪做个梯度扩 ...

谢谢你的回复。TAQ我们实验室的几个人用都突变，我构建表达质粒不敢用。另外TAQ的延伸速度不是可以达到1Kb/min，延伸10min有点长吧。现在问题是回到最初的反应体系和程序不是P不出来就是很严重的拖尾。
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3楼2012-05-03 18:53:20
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双鱼猫咪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wcx蜗牛: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-05-05 10:27:38
wcx蜗牛: 金币+2 2012-05-05 10:29:32
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-05 13:37:21
所有的试剂、体系都按之前能P出来的条件，一个用普通的你原来用的PCR仪，另一个用梯度PCR仪，在你原来退火温度上下加减5度，看看能不能P出来。我以前也是按原来的体系、条件发现P不出来，就是用梯度重新摸索的。体系中任何一个试剂的改变都可能有影响，试试看吧，祝你好运
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4楼2012-05-04 14:15:12
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