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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 做的质粒应该是6000bp。结果提质粒后跑胶只有3000bp左右
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hufan2441

铁虫 (小有名气)

[求助] 做的质粒应该是6000bp。结果提质粒后跑胶只有3000bp左右 已有3人参与

酶切后5500bp的载体和600bp的目的片段连接、转化、培养、提质粒后跑胶只有3000bp左右了，这应该是哪个方面出了问题呢？
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1楼 2015-11-26 21:48:35
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xufengnbu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定没用错marker? 电泳图看看

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hufan2441
why is the way to success
2楼2015-11-26 21:52:57
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hufan2441

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by xufengnbu at 2015-11-26 21:52:57
确定没用错marker? 电泳图看看

左边是5000Marker,右边是10000的
做的质粒应该是6000bp。结果提质粒后跑胶只有3000bp左右



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3楼2015-11-26 22:12:44
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misang

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是酶切了电泳还是没有切？是用双酶切的吗？

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4楼2015-11-26 22:22:46
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匿名

用户注销 (著名写手)
本帖仅楼主可见
5楼2015-11-26 22:35:19
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xufengnbu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by hufan2441 at 2015-11-26 22:12:44
左边是5000Marker,右边是10000的

...

质粒电泳图吧，你可以用抽提的质粒再酶切验证一下。如果之前的菌液pcr也能扩出目的条带，酶切质粒也能切开，就没问题了。

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why is the way to success
6楼2015-11-27 07:02:09
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hufan2441

铁虫 (小有名气)
上面那个很淡的条带和我要的挺吻合的

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7楼2015-11-27 09:04:48
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q120465872

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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hufan2441: 金币+40, ★★★★★最佳答案 2015-11-30 10:24:44
质粒有三种形态的，我前面给人回帖讲过这个，不过手机不太好找出来给你看。简单点说就是，质粒大部分是超螺旋态，跑的比线性DNA快，所以跟marker比显得比较小。另外开环形态的比例较低，大小跟marker一致，这就是你看到的浅带为什么正确。所以你的质粒应该没问题。


睡懒觉迷糊中，质粒三个形态的概念记不清了，我说的可能有疏漏，但大概是那么个意思，你自己再查查吧，百度都可以查到。

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hufan2441
赐予我力量，去改变我所能改变的；赐予我勇气，去接受我所不能改变的；并赐予我智慧，去分辨这两者。
8楼2015-11-27 09:12:00
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hufan2441

铁虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by q120465872 at 2015-11-27 09:12:00
质粒有三种形态的，我前面给人回帖讲过这个，不过手机不太好找出来给你看。简单点说就是，质粒大部分是超螺旋态，跑的比线性DNA快，所以跟marker比显得比较小。另外开环形态的比例较低，大小跟marker一致，这就是你 ...

我们实验室其他人好像没这种情况，我最近的几次都出现了这种情况，是我提质粒的操作有什么问题吗？

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9楼2015-11-30 10:36:24
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q120465872

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hufan2441 at 2015-11-30 10:36:24
我们实验室其他人好像没这种情况，我最近的几次都出现了这种情况，是我提质粒的操作有什么问题吗？
...

这个状况其实并不影响你后续的实验，如果你能确定你实验过程没有问题。不放心可以酶切或者测序确定。
正常的质粒，浓度较高的情况下很容易看到三条带的，不需要过分纠结这个问题。
不过需要注意一点，提质粒过程中试剂盒说明书上有提醒的，裂解时间、不能剧烈摇晃。这些步骤有可能导致基因组污染

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赐予我力量，去改变我所能改变的；赐予我勇气，去接受我所不能改变的；并赐予我智慧，去分辨这两者。
10楼2015-11-30 12:57:28
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