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长片段PCR扩增 已有2人参与
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| 大家好，想请教下：我做全长克隆，分两段分别设计引物扩增目的片段，先反转为cDNA，再PCR。我的片段一段为4324bp，一段为2100bp，但是4324bp的一直扩增不出来，引物二聚体挺亮。2100bp扩增出来了，但特异性不好。我用的takara的PrimeScript II 1st Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA，PCR用PrimeSTAR Max DNA Polymerase和LA Taq with GC Buffer 分别扩增过，长片段一直也扩增不出来，我的PCR程序：98℃ 2min,(98℃ 10s, 60℃ 15s, 72℃ 5min)*35, 72℃ 5min。中途解链时间，退火温度时间均延长过，一直没结果。引物是没有问题的，已检查比对过。谢谢。 |
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