| 查看: 5042 | 回复: 8 | |||
Deng_Cheng铁虫 (小有名气)
|
[求助]
IPTG诱导蛋白表达 已有3人参与
|
|
1. 当OD=0.6左右时，加入IPTG诱导目的基因的表达，如果设置对照为不加入IPTG，则对照组经过相同的诱导条件后，菌液发生了什么变化，是一直在繁殖吗？ 2. 原核表达时，IPTG诱导时，如何设置对照？ |
回复此楼» 猜你喜欢
压国家一区线，求导师收留，有恩必谢！
已经有4人回复
-
081200-314
已经有4人回复
-
289求调剂
已经有9人回复
-
085405 考的11408求各位老师带走
已经有3人回复
-
339求调剂
已经有6人回复
-
材料与化工272求调剂
已经有4人回复
-
085701环境工程，267求调剂
已经有15人回复
-
材料求调剂一志愿哈工大324
已经有9人回复
-
292求调剂
已经有15人回复
-
304求调剂
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助：用Iptg诱导大肠杆菌表达蛋白时，Iptg的
已经有2人回复
- 表达菌Rosetta IPTG诱导表达
已经有6人回复
- 大家好请问 重组蛋白IPTG诱导表达，从菌体长到什么时候开始，
已经有11人回复
- IPTG诱导表达
已经有8人回复
- 重组工程菌在诱导蛋白表达的时候，加入诱导剂，蛋白表达量反而下降，是怎么回事？
已经有4人回复
- 诱导蛋白表达
已经有2人回复
- 关于IPTG诱导蛋白表达的几个问题
已经有7人回复
- 片段采取无缝克隆重组后，测序结果正确，但用IPTG诱导后，都未见目的蛋白表达
已经有9人回复
- IPTG诱导表达蛋白
已经有7人回复
- IPTG诱导蛋白表达 上清和沉淀中均无目的蛋白 寻求各位大神帮助o(︶︿︶)o唉
已经有4人回复
- 低温诱导蛋白表达时用多少度合适？
已经有16人回复
- IPTG诱导表达蛋白
已经有14人回复
- 请问pET30b这个载体在IPTG诱导后有没有可能表达除了目的蛋白以外的其他蛋白？
已经有16人回复
- 无IPTG诱导蛋白依然很好表达
已经有13人回复
- 原核表达IPTG诱导后样品处理
已经有2人回复
- T7载体的IPTG诱导
已经有10人回复
- IPTG诱导
已经有15人回复
2楼2015-10-19 13:23:48
Deng_Cheng
铁虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 711.8
- 帖子: 107
- 在线: 26.9小时
- 虫号: 3763530
- 注册: 2015-03-25
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2015-10-19 15:08:50
4楼2015-10-19 17:40:39
Deng_Cheng
铁虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 711.8
- 帖子: 107
- 在线: 26.9小时
- 虫号: 3763530
- 注册: 2015-03-25
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
5楼2015-10-19 19:31:11
恶魔的左眼
木虫 (正式写手)
- 应助: 110 (高中生)
- 金币: 2237.7
- 红花: 20
- 帖子: 425
- 在线: 880.6小时
- 虫号: 3705608
- 注册: 2015-03-03
- 专业: 蛋白质组学
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
实验方案 1. 用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因； 2. 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中； 3. 分别挑取单菌落接种于5mL LB(0.1g/L 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜； 4. 以2%体积比转接于2ml LB(0.1g/L 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期，加0.1mmol/L IPTG 2μl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照； 5. 取上述菌液 1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀； 6. 重悬于冰的100μl PBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10min变性，12,000rpm离心10min； 7. 分别取诱导前和诱导后的样品10μl进行SDS-PAGE电泳分析。 （PS：如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养3-5h） 摘自原核蛋白表达纯化>原核蛋白表达纯化 |
6楼2015-10-20 09:15:43
7楼2015-10-20 12:11:06
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2015-10-21 11:27:27
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
我认为，对照应为空载质粒，而不是不加IPTG,原因如下： 1.IPTG会抑制细胞生长，以不加IPTG为对照，那么对照组和实验组的菌体生长不同步，在以后全细胞蛋白分析中，大肠杆菌自身的蛋白会有较大差异，影响判断。 2.培养基中成分复杂，比如LB培养基中的酵母抽提物含有少量乳糖，就算不加IPTG，蛋白也会被乳糖诱导，导致蛋白分析时背景表达影响实验结果。 3.以空载载体做空白，对照和实验组都加IPTG，那么实验中的变量就是有无目的基因的表达。这样就不存在蛋白的背景表达，之后的蛋白分析就十分方便且清晰，并且可以评估外源蛋白表达对菌体生长的影响。 [ 发自小木虫客户端 ] |
9楼2015-10-21 15:35:56
