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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » IPTG诱导蛋白表达
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)

[求助] IPTG诱导蛋白表达 已有3人参与

1.   当OD=0.6左右时，加入IPTG诱导目的基因的表达，如果设置对照为不加入IPTG，则对照组经过相同的诱导条件后，菌液发生了什么变化，是一直在繁殖吗？
2.  原核表达时，IPTG诱导时，如何设置对照？
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1楼 2015-10-19 11:56:18
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syhzlsd

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Deng_Cheng: 金币+7, ★有帮助 2015-10-19 15:05:59
Deng_Cheng: 金币+3 2015-10-19 19:35:22
1、菌液依旧在正常生长，只是你的诱导温度可能不是它的最适生长温度，所以长得不一定很快；
2、对照就是不加IPTG就可以了，或者你可以加1-2%的葡萄糖在对照里，也可以用空载体做对照！
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2楼2015-10-19 13:23:48
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by syhzlsd at 2015-10-19 13:23:48
1、菌液依旧在正常生长，只是你的诱导温度可能不是它的最适生长温度，所以长得不一定很快；
2、对照就是不加IPTG就可以了，或者你可以加1-2%的葡萄糖在对照里，也可以用空载体做对照！

还想请问一下，对于诱导前后总蛋白、诱导后可溶性蛋白的检测，电泳前怎么样收集与处理菌体，制作电泳的样品？
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3楼2015-10-19 15:08:50
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syhzlsd

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Deng_Cheng at 2015-10-19 15:08:50
还想请问一下，对于诱导前后总蛋白、诱导后可溶性蛋白的检测，电泳前怎么样收集与处理菌体，制作电泳的样品？...

1、取诱导后菌液500ul，离心6000rpm，5min，去上清；
2、沉淀加500ulddH2O，离心6000rpm，5min，去上清，洗去培养基；
3、沉淀加入70ul 2*loading buffer，煮样100度，25min；
4、离心6000rpm，3min；
5、去上清点样，5、6ul就可以了！
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4楼2015-10-19 17:40:39
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by syhzlsd at 2015-10-19 17:40:39
1、取诱导后菌液500ul，离心6000rpm，5min，去上清；
2、沉淀加500ulddH2O，离心6000rpm，5min，去上清，洗去培养基；
3、沉淀加入70ul 2*loading buffer，煮样100度，25min；
4、离心6000rpm，3min；
5、去上 ...

2中洗去培养基是必须的步骤吗？
3中25min是不是有点长啊？
5中取上清点样，是不是说明沉淀中蛋白已经溶到上清中了，这是什么原理？
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5楼2015-10-19 19:31:11
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
实验方案

1. 用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；
2. 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；
3. 分别挑取单菌落接种于5mL LB(0.1g/L 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；
4. 以2%体积比转接于2ml LB(0.1g/L 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期，加0.1mmol/L IPTG 2μl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照；
5. 取上述菌液 1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀；
6. 重悬于冰的100μl PBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10min变性，12,000rpm离心10min；
7. 分别取诱导前和诱导后的样品10μl进行SDS-PAGE电泳分析。
（PS：如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养3-5h）

摘自原核蛋白表达纯化>原核蛋白表达纯化
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
6楼2015-10-20 09:15:43
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syhzlsd

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Deng_Cheng at 2015-10-19 19:31:11
2中洗去培养基是必须的步骤吗？
3中25min是不是有点长啊？
5中取上清点样，是不是说明沉淀中蛋白已经溶到上清中了，这是什么原理？...

洗去培养基不是必须步骤，只是预防培养基会影响SDS-PAGE效果；
15min就可以，有时跑的条带会拖，所以就煮的稍微长一点；
因为loading buffer中有SDS，可以破坏细胞膜，使细胞中蛋白溶出来！
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7楼2015-10-20 12:11:06
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
8楼2015-10-21 11:27:27
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han3028730

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我认为，对照应为空载质粒，而不是不加IPTG,原因如下：
1.IPTG会抑制细胞生长，以不加IPTG为对照，那么对照组和实验组的菌体生长不同步，在以后全细胞蛋白分析中，大肠杆菌自身的蛋白会有较大差异，影响判断。
2.培养基中成分复杂，比如LB培养基中的酵母抽提物含有少量乳糖，就算不加IPTG，蛋白也会被乳糖诱导，导致蛋白分析时背景表达影响实验结果。
3.以空载载体做空白，对照和实验组都加IPTG，那么实验中的变量就是有无目的基因的表达。这样就不存在蛋白的背景表达，之后的蛋白分析就十分方便且清晰，并且可以评估外源蛋白表达对菌体生长的影响。

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9楼2015-10-21 15:35:56
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