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Deng_Cheng铁虫 (小有名气)
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IPTG诱导蛋白表达 已有3人参与
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1. 当OD=0.6左右时，加入IPTG诱导目的基因的表达，如果设置对照为不加入IPTG，则对照组经过相同的诱导条件后，菌液发生了什么变化，是一直在繁殖吗？ 2. 原核表达时，IPTG诱导时，如何设置对照？ |
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2楼2015-10-19 13:23:48
Deng_Cheng
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5楼2015-10-19 19:31:11
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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实验方案 1. 用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因； 2. 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中； 3. 分别挑取单菌落接种于5mL LB(0.1g/L 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜； 4. 以2%体积比转接于2ml LB(0.1g/L 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5hr，至细菌对数生长期，加0.1mmol/L IPTG 2μl诱导3-4hr，同时设立不加IPTG诱导作为对照； 5. 取上述菌液 1mL，12000rpm离心10min，收菌沉淀； 6. 重悬于冰的100μl PBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L。震荡器震荡混匀，加入2×加样缓冲液，煮沸10min变性，12,000rpm离心10min； 7. 分别取诱导前和诱导后的样品10μl进行SDS-PAGE电泳分析。 （PS：如果表达载体的原核启动子为PL启动子，则在30-32℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6，迅速使温度升至42℃继续培养3-5h；如果表达载体的原核启动子为tac等，则37℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养3-5h） 摘自原核蛋白表达纯化>原核蛋白表达纯化 |
6楼2015-10-20 09:15:43
7楼2015-10-20 12:11:06
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本帖内容被屏蔽 |
8楼2015-10-21 11:27:27
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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我认为，对照应为空载质粒，而不是不加IPTG,原因如下： 1.IPTG会抑制细胞生长，以不加IPTG为对照，那么对照组和实验组的菌体生长不同步，在以后全细胞蛋白分析中，大肠杆菌自身的蛋白会有较大差异，影响判断。 2.培养基中成分复杂，比如LB培养基中的酵母抽提物含有少量乳糖，就算不加IPTG，蛋白也会被乳糖诱导，导致蛋白分析时背景表达影响实验结果。 3.以空载载体做空白，对照和实验组都加IPTG，那么实验中的变量就是有无目的基因的表达。这样就不存在蛋白的背景表达，之后的蛋白分析就十分方便且清晰，并且可以评估外源蛋白表达对菌体生长的影响。 [ 发自小木虫客户端 ] |
9楼2015-10-21 15:35:56
