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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
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397608492

新虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼 2015-10-04 23:56:25
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

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397608492
4楼2015-10-05 12:29:11
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duoyidian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:31
可以这样筛选：
先用His缺陷型筛选，即MGY或者MD培养级进行初筛；等大概一天左右的时间，班上出现略微明显的菌落之后，将菌落用2-3ml无菌水洗下来，富集菌体，测定菌浓OD600，0.04OD，0.12OD，0.2OD菌体（取大概50,150,250ul）进行梯度筛选，G418的浓度分别对应1,2,4mg/ml，涂板之后培养2-3天即可
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6楼2015-10-05 18:53:14
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-08 07:27:43
是每一个梯度下挑几个做摇瓶么？
...

我们的做法是最高浓度板子上挑克隆。另外，96孔板固然方便，但是对于酵母菌，个人认为不太好用，溶氧少，空间小，建议五十毫升锥形瓶，10～15毫升装液量试试

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17楼2015-10-08 07:55:11
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

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2楼2015-10-05 00:11:58
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 00:11:58
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

是一个板挑几个么，所谓表达小试是摇瓶还是什么？还是不同梯度的各挑几个

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3楼2015-10-05 00:25:14
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397608492

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 12:29:11
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

谢谢你，还想问问摇瓶是挡板瓶还是普通的呢？因为实验室摇床无法到300rpm，最多到200rpm，害怕溶氧不行。我想做小一点的，50ml一个。选几个比较合适啊？因为我最高浓度的平板上也有接近50个。总不能都挑吧。。。

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5楼2015-10-05 12:36:22
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by duoyidian at 2015-10-05 18:53:14
可以这样筛选：
先用His缺陷型筛选，即MGY或者MD培养级进行初筛；等大概一天左右的时间，班上出现略微明显的菌落之后，将菌落用2-3ml无菌水洗下来，富集菌体，测定菌浓OD600，0.04OD，0.12OD，0.2OD菌体（取大概50 ...

谢谢你的回复，我看说明书说是富集菌体以无菌水稀释至OD600=0.002（10^5个细胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想问问平板里除了G418能不能加入氨苄？另外你的方法为什么涂布OD这么高啊？我的MD平板上长了接近上千个菌落，复筛是选取最高抗性浓度的平板上长的单菌落进行PCR验证和摇瓶复筛吗？

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7楼2015-10-06 00:26:32
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duoyidian

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:52
引用回帖:
7楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-06 00:26:32
谢谢你的回复，我看说明书说是富集菌体以无菌水稀释至OD600=0.002（10^5个细胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想问问平板里除了G418能不能加入氨苄？另外你的方法为什么涂布OD这么高啊？我的MD平板上长了接近上千 ...

1)你要筛选高拷贝菌株，由于高拷贝的概率问题，菌体量的增加是为了增加筛出高拷贝的概率，同时如果你的MD平板长出太多的菌体的话，也是正常的，因此才需要用抗生素进行第二次筛选。
2)添加氨苄为什么？没见过这么做的。
3)正常的筛出的4mg/ml的G418的板上长出的转化子的数目大概为10-20个左右。
4）复筛的不也见得是想拿那些最高抗性的平板菌落进行验证，看你的目的了，是单纯的找出最高产量菌株还是要做拷贝数与产量的关系，看个人计划与老板的安排。
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8楼2015-10-06 12:11:55
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by duoyidian at 2015-10-06 12:11:55
1)你要筛选高拷贝菌株，由于高拷贝的概率问题，菌体量的增加是为了增加筛出高拷贝的概率，同时如果你的MD平板长出太多的菌体的话，也是正常的，因此才需要用抗生素进行第二次筛选。
2)添加氨苄为什么？没见过这么 ...

我只是单纯想要获得最高产的菌株，仅此而已。

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9楼2015-10-06 13:36:53
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duoyidian

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-06 13:36:53
我只是单纯想要获得最高产的菌株，仅此而已。
...

那就直接筛啊，然后做个摇瓶就好了
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10楼2015-10-07 10:47:53
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