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毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与
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如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？ 发自小木虫Android客户端 |
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 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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谢谢你的回复，我看说明书说是富集菌体以无菌水稀释至OD600=0.002（10^5个细胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想问问平板里除了G418能不能加入氨苄？另外你的方法为什么涂布OD这么高啊？我的MD平板上长了接近上千个菌落，复筛是选取最高抗性浓度的平板上长的单菌落进行PCR验证和摇瓶复筛吗？ 发自小木虫Android客户端 |
7楼2015-10-06 00:26:32
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-10-05 00:11:58
3楼2015-10-05 00:25:14
3976084924楼2015-10-05 12:29:11
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