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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
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397608492

新虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼 2015-10-04 23:56:25
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

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397608492
4楼2015-10-05 12:29:11
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

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2楼2015-10-05 00:11:58
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 00:11:58
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

是一个板挑几个么，所谓表达小试是摇瓶还是什么？还是不同梯度的各挑几个

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3楼2015-10-05 00:25:14
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397608492

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 12:29:11
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

谢谢你，还想问问摇瓶是挡板瓶还是普通的呢？因为实验室摇床无法到300rpm，最多到200rpm，害怕溶氧不行。我想做小一点的，50ml一个。选几个比较合适啊？因为我最高浓度的平板上也有接近50个。总不能都挑吧。。。

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5楼2015-10-05 12:36:22
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