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毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与
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如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？ 发自小木虫Android客户端 |
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 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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3楼2015-10-05 00:25:14
送红花一朵 |
谢谢你，还想问问摇瓶是挡板瓶还是普通的呢？因为实验室摇床无法到300rpm，最多到200rpm，害怕溶氧不行。我想做小一点的，50ml一个。选几个比较合适啊？因为我最高浓度的平板上也有接近50个。总不能都挑吧。。。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2015-10-05 12:36:22
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谢谢你的回复，我看说明书说是富集菌体以无菌水稀释至OD600=0.002（10^5个细胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想问问平板里除了G418能不能加入氨苄？另外你的方法为什么涂布OD这么高啊？我的MD平板上长了接近上千个菌落，复筛是选取最高抗性浓度的平板上长的单菌落进行PCR验证和摇瓶复筛吗？ 发自小木虫Android客户端 |
7楼2015-10-06 00:26:32
9楼2015-10-06 13:36:53
11楼2015-10-07 12:36:15
13楼2015-10-07 17:40:08
15楼2015-10-07 22:32:39
16楼2015-10-08 07:27:43
18楼2015-10-08 09:19:03