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毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与
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如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？ 发自小木虫Android客户端 |
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19楼2015-10-08 09:21:17
21楼2015-10-08 12:26:21
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我测定酶活检测的，胞内确实有显著的活力，但是我的目的基因是通过同源臂克隆插入a信号肽的GAAGCT后，也就是维持天然N端，C端自带了载体上的myc和his tag。会有问题吗？ 发自小木虫Android客户端 |
30楼2015-10-09 07:37:17
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根据方法做了一下，很是奇怪，所有的G418 YPD平板在培养三天后依然没有酵母生长，奇怪的是有杂菌生长，而且所有的物品均已按规则灭菌或过滤，能否直接从his原始板上挑来表达？ 发自小木虫Android客户端 |
32楼2015-10-09 09:34:39
34楼2015-10-09 12:39:20
39楼2015-11-20 00:10:40