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毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与
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如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？ 发自小木虫Android客户端 |
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luwei13566
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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不确定你博莱霉素是怎么筛多拷贝的，只要方法得当1000ng筛出来的已经是多拷贝了，换pic9K再筛更高拷贝我估计分泌量不会提高多少， 1.LZ你可以破碎一下甲醇诱导后的菌体，我感觉胞内可能会有蛋白积累。如果有明显的积累那就不是表达量高低的问题。 2.如果确证是表达量低，你发酵条件的问题对表达量影响更大，代谢甲醇完全靠溶氧，转速至少200转是不行的，如果条件不允许，完全可以做一个不同梯度装液量的实验，无论拷贝数高低都拿一个转化子来做一下。 3.至于你加amp无非是想把杂菌给压下去，应该可以，就怕那个杂菌不怕amp,还是多注意注意操作吧 发自小木虫Android客户端 |
29楼2015-10-09 02:34:17
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
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梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2015-10-05 00:11:58
3楼2015-10-05 00:25:14
3976084924楼2015-10-05 12:29:11
