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新虫 (小有名气)

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[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼 2015-10-04 23:56:25

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

不确定你博莱霉素是怎么筛多拷贝的，只要方法得当1000ng筛出来的已经是多拷贝了，换pic9K再筛更高拷贝我估计分泌量不会提高多少，
1.LZ你可以破碎一下甲醇诱导后的菌体，我感觉胞内可能会有蛋白积累。如果有明显的积累那就不是表达量高低的问题。
2.如果确证是表达量低，你发酵条件的问题对表达量影响更大，代谢甲醇完全靠溶氧，转速至少200转是不行的，如果条件不允许，完全可以做一个不同梯度装液量的实验，无论拷贝数高低都拿一个转化子来做一下。
3.至于你加amp无非是想把杂菌给压下去，应该可以，就怕那个杂菌不怕amp,还是多注意注意操作吧

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