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397608492

新虫 (小有名气)

应助: 4 (幼儿园)
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虫号: 2821183
注册: 2013-11-23
专业: 生物大分子结构与功能

[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼2015-10-04 23:56:25

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

duoyidian

木虫 (正式写手)

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性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:52

引用回帖:

7楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-06 00:26:32
谢谢你的回复，我看说明书说是富集菌体以无菌水稀释至OD600=0.002（10^5个细胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想问问平板里除了G418能不能加入氨苄？另外你的方法为什么涂布OD这么高啊？我的MD平板上长了接近上千 ...

1)你要筛选高拷贝菌株，由于高拷贝的概率问题，菌体量的增加是为了增加筛出高拷贝的概率，同时如果你的MD平板长出太多的菌体的话，也是正常的，因此才需要用抗生素进行第二次筛选。
2)添加氨苄为什么？没见过这么做的。
3)正常的筛出的4mg/ml的G418的板上长出的转化子的数目大概为10-20个左右。
4）复筛的不也见得是想拿那些最高抗性的平板菌落进行验证，看你的目的了，是单纯的找出最高产量菌株还是要做拷贝数与产量的关系，看个人计划与老板的安排。