应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
51/1返回列表
查看: 5593  |  回复: 39
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

397608492

新虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-10-04 23:56:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

duoyidian

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:52
引用回帖:
7楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-06 00:26:32
谢谢你的回复，我看说明书说是富集菌体以无菌水稀释至OD600=0.002（10^5个细胞/ml），取200ul涂布YPD G418平板，想问问平板里除了G418能不能加入氨苄？另外你的方法为什么涂布OD这么高啊？我的MD平板上长了接近上千 ...

1)你要筛选高拷贝菌株，由于高拷贝的概率问题，菌体量的增加是为了增加筛出高拷贝的概率，同时如果你的MD平板长出太多的菌体的话，也是正常的，因此才需要用抗生素进行第二次筛选。
2)添加氨苄为什么？没见过这么做的。
3)正常的筛出的4mg/ml的G418的板上长出的转化子的数目大概为10-20个左右。
4）复筛的不也见得是想拿那些最高抗性的平板菌落进行验证，看你的目的了，是单纯的找出最高产量菌株还是要做拷贝数与产量的关系，看个人计划与老板的安排。
赞一下 回复此楼
8楼2015-10-06 12:11:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 40 个回答

mlbiosci

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
2楼2015-10-05 00:11:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 00:11:58
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

是一个板挑几个么，所谓表达小试是摇瓶还是什么？还是不同梯度的各挑几个

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2015-10-05 00:25:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mlbiosci

新虫 (正式写手)
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

397608492
4楼2015-10-05 12:29:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 40 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 271求调剂 +35 2261744733 2026-04-11 37/1850 2026-04-16 13:16 by jiahl2024
[考研] 急需调剂 +6 绝不放弃22 2026-04-15 6/300 2026-04-16 11:45 by lifeisbrave
[考研] 273求调剂 +6 白居不易. 2026-04-09 8/400 2026-04-15 22:02 by wooluyong
[考研] 求调剂 +11 小聂爱学习 2026-04-11 15/750 2026-04-15 21:57 by noqvsozv
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +19 电气李 2026-04-13 21/1050 2026-04-15 13:37 by 黑科技矿业
[考研] 085500求调剂材料 +11 易11122 2026-04-09 11/550 2026-04-14 17:59 by lhj2009
[考研] 各位老师好，求调剂，本科211，一志愿天津大学生物与医药学硕，差两名录取。 +11 路六六jjj 2026-04-13 11/550 2026-04-14 16:01 by zs92450
[考研] 290求调剂 +21 luoziheng 2026-04-10 23/1150 2026-04-14 15:49 by zs92450
[考研] 调剂 +12 月@163.com 2026-04-11 12/600 2026-04-14 15:37 by zs92450
[考研] 求调剂 +16 雪逢冬 2026-04-10 16/800 2026-04-14 14:27 by 逆水乘风
[考研] 085600材料与化工329分求调剂 +24 叶zilin 2026-04-13 25/1250 2026-04-14 09:20 by 试管破裂
[考研] 307求调剂 +10 tzq94092 2026-04-10 10/500 2026-04-12 08:18 by wise999
[考研] 化工调剂求导师收留！一志愿失利，踏实肯干，有植物提取科研经历 +20 yzyzx 2026-04-09 21/1050 2026-04-12 00:12 by 小小小小啦啦啦
[考研] 331求调剂 +5 王国帅 2026-04-11 5/250 2026-04-11 22:56 by 溪涧流水
[考研] 调剂 +5 文道星台 2026-04-11 5/250 2026-04-11 15:01 by 凯凯要变帅
[考研] 本人女孩 +7 吼吼， 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 一志愿东北大学控制工程085406数二英二385，求调剂 +8 Ezra_Zhang 2026-04-09 8/400 2026-04-11 09:15 by 猪会飞
[考研] 346，工科0854求调剂，专硕 +7 moser233 2026-04-10 8/400 2026-04-11 08:52 by 猪会飞
[考研] 调剂 +19 小张ZA 2026-04-10 20/1000 2026-04-10 22:08 by 猪会飞
[考研] 314求调剂 +18 xhhdjdjsjks 2026-04-09 19/950 2026-04-10 18:53 by HPUCZ
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭