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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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31楼2015-10-09 08:35:41
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by duoyidian at 2015-10-06 12:11:55
1)你要筛选高拷贝菌株，由于高拷贝的概率问题，菌体量的增加是为了增加筛出高拷贝的概率，同时如果你的MD平板长出太多的菌体的话，也是正常的，因此才需要用抗生素进行第二次筛选。
2)添加氨苄为什么？没见过这么 ...

根据方法做了一下，很是奇怪，所有的G418 YPD平板在培养三天后依然没有酵母生长，奇怪的是有杂菌生长，而且所有的物品均已按规则灭菌或过滤，能否直接从his原始板上挑来表达？

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32楼2015-10-09 09:34:39
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-09 07:37:17
我测定酶活检测的，胞内确实有显著的活力，但是我的目的基因是通过同源臂克隆插入a信号肽的GAAGCT后，也就是维持天然N端，C端自带了载体上的myc和his tag。会有问题吗？
...

跑个PAGE看看，如果胞内积累的蛋白明显那说明你的问题根本不是什么表达量高低，而是分泌不出去的问题，我估计你picza用了α信号肽上的那个XHOI了，按照说明书上那种天然N端方法只是理论上可以保留信号肽酶的切割位点，但实际情况无论是Kex2或ste13都会受到下游氨基酸序列的影响导致分泌问题，当然也不排除不利的发酵条件导致蛋白分泌失常的可能。C端带myc和his taq不确定会不会有影响，最好做一个对照实验。
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大家相互帮助哈
33楼2015-10-09 11:26:33
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397608492

新虫 (小有名气)
但用EcoRI接进去在N端也就加了两个氨基酸，这样会有影响？

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34楼2015-10-09 12:39:20
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wyfdgg

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-08 07:55:11
我们的做法是最高浓度板子上挑克隆。另外，96孔板固然方便，但是对于酵母菌，个人认为不太好用，溶氧少，空间小，建议五十毫升锥形瓶，10～15毫升装液量试试
...

您好，我们这边也是采用在高浓度班子上面挑取单克隆的方法。最高4g/l的遗传霉素抗性，但是即使如果挑取的菌落做基因组DNA的PCR验证，也只有十分之一左右的菌株含有目的条带。而且只有一条带。含有目的条带的菌株利用CM培养基做产酶培养，看不到任何条带，没有酶活。不晓得您有没有遇到过类似的情况。
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35楼2015-10-28 09:17:22
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wyfdgg

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by duoyidian at 2015-10-06 12:11:55
1)你要筛选高拷贝菌株，由于高拷贝的概率问题，菌体量的增加是为了增加筛出高拷贝的概率，同时如果你的MD平板长出太多的菌体的话，也是正常的，因此才需要用抗生素进行第二次筛选。
2)添加氨苄为什么？没见过这么 ...

您好，我用G418 4g/l的平板筛选出来的菌株，提取基因组PCR时，能够批到目的条带的菌株只有二十分之一左右。想请问这个正常吗？
另外含有目的条带的菌株进行产酶培养的时候，测不到酶活，蛋白电泳也看不到条带。请问您有遇到过类似情况吗？
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36楼2015-10-28 09:24:12
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duoyidian

木虫 (正式写手)
引用回帖:
36楼: Originally posted by wyfdgg at 2015-10-28 09:24:12
您好，我用G418 4g/l的平板筛选出来的菌株，提取基因组PCR时，能够批到目的条带的菌株只有二十分之一左右。想请问这个正常吗？
另外含有目的条带的菌株进行产酶培养的时候，测不到酶活，蛋白电泳也看不到条带。请 ...

我之前也遇到这样的情况，出现这种情况的影响因素很多
1） 比如说你提取的基因组质量不好
2）PCR也可能出问题的
3）产酶检测，酶活检测很灵敏，如果检测不到的话，就考虑一下是不是你酶的适应pH的范围，你的培养基是什么？
4）蛋白电泳能看见条带的话，就说明产量不是很低了，你酶活检测不到，估计是看不到，可以尝试western blot 检测一下。
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37楼2015-10-28 10:58:46
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思密达佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by duoyidian at 2015-10-05 18:53:14
可以这样筛选：
先用His缺陷型筛选，即MGY或者MD培养级进行初筛；等大概一天左右的时间，班上出现略微明显的菌落之后，将菌落用2-3ml无菌水洗下来，富集菌体，测定菌浓OD600，0.04OD，0.12OD，0.2OD菌体（取大概50 ...

你好，我原来没做过分子实验，请问HIS标签怎么加如何加呢？
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38楼2015-11-19 21:56:28
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
38楼: Originally posted by 思密达佳 at 2015-11-19 21:56:28
你好，我原来没做过分子实验，请问HIS标签怎么加如何加呢？...

通过引物设计接人

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39楼2015-11-20 00:10:40
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吕岩松

新虫 (初入文坛)
您可以用24孔板或48孔板试一下

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40楼2017-10-11 07:32:09
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