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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
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397608492

新虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼 2015-10-04 23:56:25
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duoyidian

木虫 (正式写手)
引用回帖:
36楼: Originally posted by wyfdgg at 2015-10-28 09:24:12
您好，我用G418 4g/l的平板筛选出来的菌株，提取基因组PCR时，能够批到目的条带的菌株只有二十分之一左右。想请问这个正常吗？
另外含有目的条带的菌株进行产酶培养的时候，测不到酶活，蛋白电泳也看不到条带。请 ...

我之前也遇到这样的情况，出现这种情况的影响因素很多
1） 比如说你提取的基因组质量不好
2）PCR也可能出问题的
3）产酶检测，酶活检测很灵敏，如果检测不到的话，就考虑一下是不是你酶的适应pH的范围，你的培养基是什么？
4）蛋白电泳能看见条带的话，就说明产量不是很低了，你酶活检测不到，估计是看不到，可以尝试western blot 检测一下。
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37楼2015-10-28 10:58:46
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

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2楼2015-10-05 00:11:58
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 00:11:58
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

是一个板挑几个么，所谓表达小试是摇瓶还是什么？还是不同梯度的各挑几个

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3楼2015-10-05 00:25:14
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

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397608492
4楼2015-10-05 12:29:11
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