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397608492

新虫 (小有名气)

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[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼 2015-10-04 23:56:25

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luwei13566

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

30楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-09 07:37:17
我测定酶活检测的，胞内确实有显著的活力，但是我的目的基因是通过同源臂克隆插入a信号肽的GAAGCT后，也就是维持天然N端，C端自带了载体上的myc和his tag。会有问题吗？
...

跑个PAGE看看，如果胞内积累的蛋白明显那说明你的问题根本不是什么表达量高低，而是分泌不出去的问题，我估计你picza用了α信号肽上的那个XHOI了，按照说明书上那种天然N端方法只是理论上可以保留信号肽酶的切割位点，但实际情况无论是Kex2或ste13都会受到下游氨基酸序列的影响导致分泌问题，当然也不排除不利的发酵条件导致蛋白分泌失常的可能。C端带myc和his taq不确定会不会有影响，最好做一个对照实验。