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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
汕头大学海洋科学接受调剂
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397608492

新虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母高拷贝筛选 已有2人参与

如题，本人新手，做蛋白分子改造的，之前将目的基因构建在pPICZaA和pGAPZaA上并利用博莱霉素筛选高拷贝，浓度达到1ug/ml，菌落PCR后挑取阳性菌落摇瓶表达，结果表达量极低。现在改变策略构建到pPIC9K上用G418筛选高拷贝，想问问各位达人G418能不能和氨苄同时使用，因为之前做的时候涂布His+转化子的G418平板老是不长酵母而长杂菌。另外还想问问是不是带有his tag的蛋白酵母的表达量会降低？因为我想要拿比较高表达量的菌株对该蛋白进行表征。有文献建议His+转化子不经过G418筛选高拷贝而直接以深孔板培养筛选高表达量菌株，各位觉得哪种方法更靠谱呢？在同一个梯度的平板上，各菌株的表达量差异会否很大？

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1楼 2015-10-04 23:56:25
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
30楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-09 07:37:17
我测定酶活检测的，胞内确实有显著的活力，但是我的目的基因是通过同源臂克隆插入a信号肽的GAAGCT后，也就是维持天然N端，C端自带了载体上的myc和his tag。会有问题吗？
...

跑个PAGE看看，如果胞内积累的蛋白明显那说明你的问题根本不是什么表达量高低，而是分泌不出去的问题，我估计你picza用了α信号肽上的那个XHOI了，按照说明书上那种天然N端方法只是理论上可以保留信号肽酶的切割位点，但实际情况无论是Kex2或ste13都会受到下游氨基酸序列的影响导致分泌问题，当然也不排除不利的发酵条件导致蛋白分泌失常的可能。C端带myc和his taq不确定会不会有影响，最好做一个对照实验。
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大家相互帮助哈
33楼2015-10-09 11:26:33
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-10-07 22:53:11
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

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2楼2015-10-05 00:11:58
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-05 00:11:58
梯度加压，增加zeocin浓度，筛选到2000的浓度，调取克隆进行表达小试进一步筛选。根据经验，高浓度板子上长出来的克隆表达量不见得高，曾有过不表达的情况。

是一个板挑几个么，所谓表达小试是摇瓶还是什么？还是不同梯度的各挑几个

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3楼2015-10-05 00:25:14
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
最高浓度板子上挑几个摇瓶表达检测

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397608492
4楼2015-10-05 12:29:11
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