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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母高拷贝筛选
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by mlbiosci at 2015-10-08 12:13:20
我不知道是否科学，我一般做十个以内。转速三百
...

你做的会有差别么？

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21楼2015-10-08 12:26:21
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 397608492 at 2015-10-08 12:26:21
你做的会有差别么？
...

表达量高低是有区别的，具体方法看你检测方法

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22楼2015-10-08 12:59:28
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
23楼2015-10-08 15:58:14
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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24楼2015-10-08 16:05:28
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-字仲康

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25楼2015-10-08 16:06:27
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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26楼2015-10-08 16:08:40
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by -字仲康 at 2015-10-08 16:08:40
我们所做的是，锥形瓶用个是500mL的，装液量为50mL，培养的转速为220rpm...

这个梯度筛选在哪个浓度表达量高还真不好预计。五百的摇瓶在初筛阶段工作量很大呀。你们测表达量用什么方法呢？

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27楼2015-10-08 17:09:53
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by -字仲康 at 2015-10-08 16:08:40
我们所做的是，锥形瓶用个是500mL的，装液量为50mL，培养的转速为220rpm...

不好意思看错了装液量了，嘿嘿。

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28楼2015-10-08 17:11:13
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不确定你博莱霉素是怎么筛多拷贝的，只要方法得当1000ng筛出来的已经是多拷贝了，换pic9K再筛更高拷贝我估计分泌量不会提高多少，
1.LZ你可以破碎一下甲醇诱导后的菌体，我感觉胞内可能会有蛋白积累。如果有明显的积累那就不是表达量高低的问题。
2.如果确证是表达量低，你发酵条件的问题对表达量影响更大，代谢甲醇完全靠溶氧，转速至少200转是不行的，如果条件不允许，完全可以做一个不同梯度装液量的实验，无论拷贝数高低都拿一个转化子来做一下。
3.至于你加amp无非是想把杂菌给压下去，应该可以，就怕那个杂菌不怕amp,还是多注意注意操作吧

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大家相互帮助哈
29楼2015-10-09 02:34:17
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397608492

新虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-10-09 02:34:17
不确定你博莱霉素是怎么筛多拷贝的，只要方法得当1000ng筛出来的已经是多拷贝了，换pic9K再筛更高拷贝我估计分泌量不会提高多少，
1.LZ你可以破碎一下甲醇诱导后的菌体，我感觉胞内可能会有蛋白积累。如果有明显的积 ...

我测定酶活检测的，胞内确实有显著的活力，但是我的目的基因是通过同源臂克隆插入a信号肽的GAAGCT后，也就是维持天然N端，C端自带了载体上的myc和his tag。会有问题吗？

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30楼2015-10-09 07:37:17
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