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loveming313

新虫 (小有名气)

[交流] 请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？

请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
1.这是属于跳跃PCR ,还是什么?
2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设置这个程序？
4.PCR程序中变性、退火、延伸的反应时间是怎么确定的？和哪些因素（如酶、扩增片段、模板）有关？

请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
搜狗截图15年09月09日PCR程序.png
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1楼 2015-09-09 17:07:27
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枭翔

金虫 (正式写手)
★
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5楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 08:05:51
是的，第9部是28个循环
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序，

2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设 ...

第一个问题，可以用普通的rTaq酶。
第二个问题，不知道你们PCR仪器是哪个公司的，你可以看看说明书。
第三个问题，变性是根据你的酶设定的、退火温度是是根据你的引物TM确定的，延长时间是根据你扩增片段大小来确定的。
附加：为什么用touchdown呢？是因为当你不确定引物的最佳退火温度的时候，可以从65度向下降，当退火温度高的时候，只有特异性条带，退火温度依次降低，那么非特异性条带可能就会出现。这时候，前面10个降落循环中，PCR产物肯定会有你的特异性条带，所以第二个延伸28个循环，然后在某一个确定退火温度下，这时候引物就会以你的特异性条带结合，然后PCR结束以后，你的目的条带才是比较亮的。
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7楼2015-09-10 09:57:34
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★
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touchdown不就是你平时怎么P还怎么P，程序多一段每循环降温么？你要是仪器不支持，或者找不到会的人，一个个循环自己输也行嘛。问这么久输都输完了。
Biorad，ABI的机器都有oC/cycles选项，自己找
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10楼2015-09-10 13:08:22
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枭翔

金虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 11:28:45
1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那这个变性、退火、延伸的反应时间怎么确定的？扩增的片段大小分别是666bp和850bp
3.能不能帮忙设计一下PCR反应条件，拜托了
这个图就是PCR鉴定程序

021302.png
...

如果你的目的是目的基因表达的话，需要换一个高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10个循环，每循环降低1°
5    95°          30s
6    55°          30s
7    72°          1min
第五步到第七步25个循环
8    72°          10min
9    10°          ∞

这个程序是以前用过的Taq酶的touchdown，你可以参考一下
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loveming313
11楼2015-09-10 13:34:14
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普通回帖

顾在

新虫 (初入文坛)
★
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你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr
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2楼2015-09-09 17:42:10
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枭翔

金虫 (正式写手)
★
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降落PCR，第5步应该10个循环，第9步应该25个循环。
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3楼2015-09-09 18:51:40
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

是突变型小鼠鉴定用的，扩增片段为850bp 和666bp,循环数第一个是10，第二个是28.
我不知道第4部后面0.5C per cycle 是什么意思？
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4楼2015-09-10 08:01:25
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-09 18:51:40
降落PCR，第5步应该10个循环，第9步应该25个循环。

是的，第9部是28个循环
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序，

2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设置这个程序？
4.PCR程序中变性、退火、延伸的反应时间是怎么确定的？和哪些因素（如酶、扩增片段、模板）有关？
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5楼2015-09-10 08:05:51
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序
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6楼2015-09-10 08:07:11
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kodey

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Touchdown PCR，循环数不够呀，PCR仪都可以设置Touchdown PCR，现在一般的Taq酶都可以做Touchdown。
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8楼2015-09-10 09:57:43
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-10 09:57:34
第一个问题，可以用普通的rTaq酶。
第二个问题，不知道你们PCR仪器是哪个公司的，你可以看看说明书。
第三个问题，变性是根据你的酶设定的、退火温度是是根据你的引物TM确定的，延长时间是根据你扩增片段大小来确 ...

1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那这个变性、退火、延伸的反应时间怎么确定的？扩增的片段大小分别是666bp和850bp
3.能不能帮忙设计一下PCR反应条件，拜托了
这个图就是PCR鉴定程序
请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？-1
021302.png
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9楼2015-09-10 11:28:45
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loveming313

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-10 13:34:14
如果你的目的是目的基因表达的话，需要换一个高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10个循环，每循环降低 ...

你好，谢谢你的建议，我稍微修改了下：每循环降低0.5℃（即退火温度从65—60），现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC TTG GCT ACC AGA，后引物TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT（后引物是共用的）
850bp目的片段的前引物是TGC CTG CTC TTT ACT GAA GG，后引物是TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT，这个扩增条件怎么设呢？
请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？-2
搜狗截图15年09月19日1420_2.png
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12楼2015-09-19 14:20:53
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-10 13:08:22

touchdown不就是你平时怎么P还怎么P，程序多一段每循环降温么？你要是仪器不支持，或者找不到会的人，一个个循环自己输也行嘛。问这么久输都输完了。
Biorad，ABI的机器都有oC/cycles选项，自己找

大侠你好，我现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC TTG GCT ACC AGA，后引物TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT（后引物是共用的）
850bp目的片段的前引物是TGC CTG CTC TTT ACT GAA GG，后引物是TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT，这个扩增条件怎么设呢？
我实在是愚笨，烦请您给个建议吧
请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？-3
搜狗截图15年09月19日1420_2.png
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13楼2015-09-19 14:29:03
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lini-828127

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这就是这touchdown pcr，bio-rad等好多机子，在设置第三步的时候选择温度降落就可以了。
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15楼2015-09-20 00:30:21
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 00:30:21
这就是这touchdown pcr，bio-rad等好多机子，在设置第三步的时候选择温度降落就可以了。

谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议

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16楼2015-09-20 08:01:44
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叶舒舒

新虫 (初入文坛)
★
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设置降落pcr，退火温度一般用TM加5，前10个循环每个循环降0.5℃，你这么短的片段，用普通taq酶也不会有问题

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17楼2015-09-20 08:17:53
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叶舒舒

新虫 (初入文坛)
扩不出来是不是前后引物tm值相差过大，或者前引物不好连接，可以把前引物重新设计

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18楼2015-09-20 08:23:27
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枭翔

金虫 (正式写手)
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12楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-19 14:20:53
你好，谢谢你的建议，我稍微修改了下：每循环降低0.5℃（即退火温度从65—60），现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC  ...

重新检查一下引物，是不是有错误
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19楼2015-09-20 11:16:59
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lini-828127

木虫 (小有名气)
★
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16楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议
...

850bp的话建议变性30s，退火30s，延伸时间60s，温度按所使用的酶定。

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20楼2015-09-20 12:13:51
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lini-828127

木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
16楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议
...

你看看是不是引物有问题，或者是模板，可以换个模板试试，检测一下引物是否有问题

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21楼2015-09-20 12:16:38
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 12:13:51
850bp的话建议变性30s，退火30s，延伸时间60s，温度按所使用的酶定。
...

哎，没有及时看帖子，我已经用变性30s,退火60s，延伸60s,进行退火57±7℃梯度PCR了，祈祷有条带出来呀
弱弱地问一句，退火的时间跟什么有关
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22楼2015-09-20 15:01:27
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lini-828127

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
貌似是和引物与序列匹配有关

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23楼2015-09-21 00:13:29
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loveming313

新虫 (小有名气)
又出现问题了，只能P出666bp野生型条带，P不出850bp条带
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24楼2016-01-21 16:35:00
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大小白白14楼
2015-09-19 17:47   回复  
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