[交流] 请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？

5楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 08:05:51
是的，第9部是28个循环
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序，

2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设 ...

9楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 11:28:45
1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那这个变性、退火、延伸的反应时间怎么确定的？扩增的片段大小分别是666bp和850bp
3.能不能帮忙设计一下PCR反应条件，拜托了
这个图就是PCR鉴定程序

021302.png
...

2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

3楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-09 18:51:40
降落PCR，第5步应该10个循环，第9步应该25个循环。

2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

7楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-10 09:57:34
第一个问题，可以用普通的rTaq酶。
第二个问题，不知道你们PCR仪器是哪个公司的，你可以看看说明书。
第三个问题，变性是根据你的酶设定的、退火温度是是根据你的引物TM确定的，延长时间是根据你扩增片段大小来确 ...

11楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-10 13:34:14
如果你的目的是目的基因表达的话，需要换一个高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10个循环，每循环降低 ...

10楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-10 13:08:22

touchdown不就是你平时怎么P还怎么P，程序多一段每循环降温么？你要是仪器不支持，或者找不到会的人，一个个循环自己输也行嘛。问这么久输都输完了。
Biorad，ABI的机器都有oC/cycles选项，自己找

15楼: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 00:30:21
这就是这touchdown pcr，bio-rad等好多机子，在设置第三步的时候选择温度降落就可以了。

12楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-19 14:20:53
你好，谢谢你的建议，我稍微修改了下：每循环降低0.5℃（即退火温度从65—60），现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC  ...

16楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议
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16楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议
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20楼: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 12:13:51
850bp的话建议变性30s，退火30s，延伸时间60s，温度按所使用的酶定。
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