应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
241/1返回列表
查看: 6451  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

loveming313

新虫 (小有名气)

[交流] 请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？

请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
1.这是属于跳跃PCR ,还是什么?
2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设置这个程序？
4.PCR程序中变性、退火、延伸的反应时间是怎么确定的？和哪些因素（如酶、扩增片段、模板）有关？

请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
搜狗截图15年09月09日PCR程序.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2015-09-09 17:07:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

枭翔

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 08:05:51
是的，第9部是28个循环
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序，

2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设 ...

第一个问题，可以用普通的rTaq酶。
第二个问题，不知道你们PCR仪器是哪个公司的，你可以看看说明书。
第三个问题，变性是根据你的酶设定的、退火温度是是根据你的引物TM确定的，延长时间是根据你扩增片段大小来确定的。
附加：为什么用touchdown呢？是因为当你不确定引物的最佳退火温度的时候，可以从65度向下降，当退火温度高的时候，只有特异性条带，退火温度依次降低，那么非特异性条带可能就会出现。这时候，前面10个降落循环中，PCR产物肯定会有你的特异性条带，所以第二个延伸28个循环，然后在某一个确定退火温度下，这时候引物就会以你的特异性条带结合，然后PCR结束以后，你的目的条带才是比较亮的。
赞一下(3人) 回复此楼
7楼2015-09-10 09:57:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biostar2009

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

touchdown不就是你平时怎么P还怎么P，程序多一段每循环降温么？你要是仪器不支持，或者找不到会的人，一个个循环自己输也行嘛。问这么久输都输完了。
Biorad，ABI的机器都有oC/cycles选项，自己找
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2015-09-10 13:08:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枭翔

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 11:28:45
1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那这个变性、退火、延伸的反应时间怎么确定的？扩增的片段大小分别是666bp和850bp
3.能不能帮忙设计一下PCR反应条件，拜托了
这个图就是PCR鉴定程序

021302.png
...

如果你的目的是目的基因表达的话，需要换一个高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10个循环，每循环降低1°
5    95°          30s
6    55°          30s
7    72°          1min
第五步到第七步25个循环
8    72°          10min
9    10°          ∞

这个程序是以前用过的Taq酶的touchdown，你可以参考一下
赞一下(1人) 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

loveming313
11楼2015-09-10 13:34:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

顾在

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr
赞一下 回复此楼
2楼2015-09-09 17:42:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枭翔

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
降落PCR，第5步应该10个循环，第9步应该25个循环。
赞一下 回复此楼
3楼2015-09-09 18:51:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

是突变型小鼠鉴定用的，扩增片段为850bp 和666bp,循环数第一个是10，第二个是28.
我不知道第4部后面0.5C per cycle 是什么意思？
赞一下 回复此楼
4楼2015-09-10 08:01:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-09 18:51:40
降落PCR，第5步应该10个循环，第9步应该25个循环。

是的，第9部是28个循环
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序，

2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设置这个程序？
4.PCR程序中变性、退火、延伸的反应时间是怎么确定的？和哪些因素（如酶、扩增片段、模板）有关？
赞一下 回复此楼
5楼2015-09-10 08:05:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-10 08:07:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kodey

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
Touchdown PCR，循环数不够呀，PCR仪都可以设置Touchdown PCR，现在一般的Taq酶都可以做Touchdown。
赞一下 回复此楼
8楼2015-09-10 09:57:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-10 09:57:34
第一个问题，可以用普通的rTaq酶。
第二个问题，不知道你们PCR仪器是哪个公司的，你可以看看说明书。
第三个问题，变性是根据你的酶设定的、退火温度是是根据你的引物TM确定的，延长时间是根据你扩增片段大小来确 ...

1.我用的酶是Thermo家的Taq DNA Polymerase
2.那这个变性、退火、延伸的反应时间怎么确定的？扩增的片段大小分别是666bp和850bp
3.能不能帮忙设计一下PCR反应条件，拜托了
这个图就是PCR鉴定程序
请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？-1
021302.png
赞一下 回复此楼
9楼2015-09-10 11:28:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by 枭翔 at 2015-09-10 13:34:14
如果你的目的是目的基因表达的话，需要换一个高保真的酶，Taq不行。

1    95°          5min
2    95°          30s
3    65°          30s
4    72°          1min
第二步到第四步10个循环，每循环降低 ...

你好，谢谢你的建议，我稍微修改了下：每循环降低0.5℃（即退火温度从65—60），现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC TTG GCT ACC AGA，后引物TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT（后引物是共用的）
850bp目的片段的前引物是TGC CTG CTC TTT ACT GAA GG，后引物是TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT，这个扩增条件怎么设呢？
请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？-2
搜狗截图15年09月19日1420_2.png
赞一下 回复此楼
12楼2015-09-19 14:20:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by biostar2009 at 2015-09-10 13:08:22

touchdown不就是你平时怎么P还怎么P，程序多一段每循环降温么？你要是仪器不支持，或者找不到会的人，一个个循环自己输也行嘛。问这么久输都输完了。
Biorad，ABI的机器都有oC/cycles选项，自己找

大侠你好，我现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC TTG GCT ACC AGA，后引物TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT（后引物是共用的）
850bp目的片段的前引物是TGC CTG CTC TTT ACT GAA GG，后引物是TTC CAT TAC AGT CAC TCC AGA TGT，这个扩增条件怎么设呢？
我实在是愚笨，烦请您给个建议吧
请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？-3
搜狗截图15年09月19日1420_2.png
赞一下 回复此楼
13楼2015-09-19 14:29:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lini-828127

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这就是这touchdown pcr，bio-rad等好多机子，在设置第三步的时候选择温度降落就可以了。
赞一下 回复此楼
15楼2015-09-20 00:30:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 00:30:21
这就是这touchdown pcr，bio-rad等好多机子，在设置第三步的时候选择温度降落就可以了。

谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
16楼2015-09-20 08:01:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叶舒舒

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
设置降落pcr，退火温度一般用TM加5，前10个循环每个循环降0.5℃，你这么短的片段，用普通taq酶也不会有问题

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
17楼2015-09-20 08:17:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

叶舒舒

新虫 (初入文坛)
扩不出来是不是前后引物tm值相差过大，或者前引物不好连接，可以把前引物重新设计

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
18楼2015-09-20 08:23:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

枭翔

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
12楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-19 14:20:53
你好，谢谢你的建议，我稍微修改了下：每循环降低0.5℃（即退火温度从65—60），现在能跑出666bp的野生型条带【如图，Marker为DL100】；但850bp的条带P不出来，很让人着急。
666bp目的片段的前引物是TCA GTT TCC  ...

重新检查一下引物，是不是有错误
赞一下 回复此楼
19楼2015-09-20 11:16:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lini-828127

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议
...

850bp的话建议变性30s，退火30s，延伸时间60s，温度按所使用的酶定。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
20楼2015-09-20 12:13:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lini-828127

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-20 08:01:44
谢谢回复，我知道怎么PCR，是想麻烦虫友是否能够对850bp目的扩增条带，引物如上所说，提供一些反应条件的建议
...

你看看是不是引物有问题，或者是模板，可以换个模板试试，检测一下引物是否有问题

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
21楼2015-09-20 12:16:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by lini-828127 at 2015-09-20 12:13:51
850bp的话建议变性30s，退火30s，延伸时间60s，温度按所使用的酶定。
...

哎，没有及时看帖子，我已经用变性30s,退火60s，延伸60s,进行退火57±7℃梯度PCR了，祈祷有条带出来呀
弱弱地问一句，退火的时间跟什么有关
赞一下 回复此楼
22楼2015-09-20 15:01:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lini-828127

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
貌似是和引物与序列匹配有关

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
23楼2015-09-21 00:13:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

loveming313

新虫 (小有名气)
又出现问题了，只能P出666bp野生型条带，P不出850bp条带
赞一下 回复此楼
24楼2016-01-21 16:35:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
大小白白14楼
2015-09-19 17:47   回复  
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
发自小木虫Android客户端
相关版块跳转 我要订阅楼主 loveming313 的主题更新
241/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭