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loveming313

新虫 (小有名气)

[交流] 请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？

请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
1.这是属于跳跃PCR ,还是什么?
2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设置这个程序？
4.PCR程序中变性、退火、延伸的反应时间是怎么确定的？和哪些因素（如酶、扩增片段、模板）有关？

请大家帮帮忙，这个PCR程序是什么意思？如何在PCR仪上设置？
搜狗截图15年09月09日PCR程序.png
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1楼 2015-09-09 17:07:27
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枭翔

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by loveming313 at 2015-09-10 08:05:51
是的，第9部是28个循环
https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:2:0::NO:22_MASTER_PROTOCOL_ID,P2_JRS_CODE:10238,021302
是这个网站上的鉴定程序，

2.这种PCR用普通taq酶可以P吗？
3.在PCR仪上如何设 ...

第一个问题，可以用普通的rTaq酶。
第二个问题，不知道你们PCR仪器是哪个公司的，你可以看看说明书。
第三个问题，变性是根据你的酶设定的、退火温度是是根据你的引物TM确定的，延长时间是根据你扩增片段大小来确定的。
附加：为什么用touchdown呢？是因为当你不确定引物的最佳退火温度的时候，可以从65度向下降，当退火温度高的时候，只有特异性条带，退火温度依次降低，那么非特异性条带可能就会出现。这时候，前面10个降落循环中，PCR产物肯定会有你的特异性条带，所以第二个延伸28个循环，然后在某一个确定退火温度下，这时候引物就会以你的特异性条带结合，然后PCR结束以后，你的目的条带才是比较亮的。
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7楼2015-09-10 09:57:34
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顾在

新虫 (初入文坛)
★
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你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr
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2楼2015-09-09 17:42:10
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枭翔

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
降落PCR，第5步应该10个循环，第9步应该25个循环。
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3楼2015-09-09 18:51:40
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loveming313

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 顾在 at 2015-09-09 17:42:10
你这是做什么实验用的呢，循环数也没有，退火温度是与引物相关，而延伸时间与扩增片段大小相关，大概只知道是两步pcr

是突变型小鼠鉴定用的，扩增片段为850bp 和666bp,循环数第一个是10，第二个是28.
我不知道第4部后面0.5C per cycle 是什么意思？
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4楼2015-09-10 08:01:25
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大小白白14楼
2015-09-19 17:47   回复  
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