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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR后电泳的结果好奇怪，求帮忙分析。
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ly476779208

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR后电泳的结果好奇怪，求帮忙分析。 已有2人参与

PCR做了两个片段，A:1245bp；B1：2982bp；B2：2982bp
PCR体系如下：
试剂        体积（ 20ul）
ddH2O                9.6ul
10 x buffer          4ul
10×dNTP（2 .5mM）2ul
上游Primer（10 μM) 1ul
下游Primer（10 μM) 1ul
模板（123 ng/mL ) 2ul
酶   0.4ul
PCR条件：
98℃   30s
98℃   10s
55℃   30s
72℃/68℃   Xmin
goto   5×
98℃   30s
98℃   10s
57℃   30s
72℃/68℃   Xmin
goto   28×
72℃/68℃   10min
4℃  保存

三个样，每个做了四管，先mix后分装，同一个体系配置的。1kb marker
A用GXL酶P的，所以延伸温度是68℃，电泳后结果不错，条带明亮，至今做过的最好的……（新手QAQ）
B1，B2用的phusion酶，延伸温度72℃，电泳后条带如图。
不知道为什么会出现这种条带有的没有，有的明亮有的暗淡的现象，因为是一个体系配的呀，确定各组分都加了。那么出现这种结果的原因是什么呢，明亮的条带是正确的吗？

PCR后电泳的结果好奇怪，求帮忙分析。
A电泳结果 条带明亮.png


PCR后电泳的结果好奇怪，求帮忙分析。-1
B1.png


PCR后电泳的结果好奇怪，求帮忙分析。-2
B2.png
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做实验哦QAQ
1楼 2015-08-26 09:06:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

BBMC-2012

木虫 (知名作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ly476779208 at 2015-08-26 10:18:55
恩恩，图二图三的回收到的才1.4-2.4ng/ul左右。上次也出现这种情况，浓度特别低，所以就用回收到的目的片段当模板来二扩，结果电泳没条带，说明回收到的不是目的片段。所以我感觉这次也是一样……条带暗淡的话很难 ...

这倒是真的啊！要不直接pcr产物二次pcr

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11楼2015-08-26 10:25:26
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普通回帖

BBMC-2012

木虫 (知名作家)
很正常，有时候！可以用

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2楼2015-08-26 09:42:06
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ly476779208

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by BBMC-2012 at 2015-08-26 09:42:06
很正常，有时候！可以用

好的，谢谢
我还想问问，图一那个胶，我进行后续切胶回收，四管合一终浓度才28.1ng/ul，这个回收效率是不是低了？图二图三基本上没回收到……
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做实验哦QAQ
3楼2015-08-26 09:49:14
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BBMC-2012

木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ly476779208 at 2015-08-26 09:49:14
好的，谢谢
我还想问问，图一那个胶，我进行后续切胶回收，四管合一终浓度才28.1ng/ul，这个回收效率是不是低了？图二图三基本上没回收到……...

还好吧，可以啦！平时我只是10几

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4楼2015-08-26 09:59:06
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BBMC-2012

木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ly476779208 at 2015-08-26 09:49:14
好的，谢谢
我还想问问，图一那个胶，我进行后续切胶回收，四管合一终浓度才28.1ng/ul，这个回收效率是不是低了？图二图三基本上没回收到……...

这还好吧，应该有产物连接试试

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5楼2015-08-26 10:00:19
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929519755

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么退火温度先用55℃p5个cycle，在用57℃呢？
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想你没话说
6楼2015-08-26 10:02:36
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929519755

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
ly476779208: 金币+2, ★有帮助, 还是谢谢哦 2015-08-27 10:55:09
如果你想增强特异性，又要获得较高产率，不是先用较高的退火温度，再用较低的退火温度好点吗？
感觉你这个用反了…………………………
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想你没话说
7楼2015-08-26 10:05:02
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ly476779208

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 929519755 at 2015-08-26 10:05:02
如果你想增强特异性，又要获得较高产率，不是先用较高的退火温度，再用较低的退火温度好点吗？
感觉你这个用反了…………………………

师姐的解释是，先用低的退火温度降低特异性，多扩增一下，然后再提高退火温度增强特异性，从而扩增目的片段。类似于增加了一些模板吧。
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做实验哦QAQ
8楼2015-08-26 10:15:37
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ly476779208

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by BBMC-2012 at 2015-08-26 09:59:06
还好吧，可以啦！平时我只是10几
...

恩恩，图二图三的回收到的才1.4-2.4ng/ul左右。上次也出现这种情况，浓度特别低，所以就用回收到的目的片段当模板来二扩，结果电泳没条带，说明回收到的不是目的片段。所以我感觉这次也是一样……条带暗淡的话很难回收到吗…QAQ
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做实验哦QAQ
9楼2015-08-26 10:18:55
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929519755

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

……
没有见过这样的
如果你感觉产物太少，可以多扩增几个cycle啊
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想你没话说
10楼2015-08-26 10:19:49
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