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PCR
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亲们，最近在细胞中提取RNA,然后反转录，PCR，跑胶，遇到很多问题，想和各位大侠交流一下，不胜感激。 1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？ 2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？ 3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？ 4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？  谢谢，谢谢啊  55℃PCR.jpg  45℃PCR.jpg  IMG_20130712_205646.jpg  IMG_20130712_205711.jpg [ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ] |
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loveskyzhou
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2楼2013-07-19 10:48:18
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孙启亮
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【答案】应助回帖
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小瞎子(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 12:07:00
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致楼主： 首先你的胶咋这样？溴化乙锭加多了吧 感觉你所有的引物都有问题，看引物浓度是不是太高才形成了那么多非特异扩增，若不是，建议重新设计引物。 楼主的操作应该不是很熟练，不知RNA质量如何，你说的trizol法提RNA不知所用试剂购自哪里，若是inviitrigen的，裂解时间较长，大约15min左右。 提取的RNA要有质量验证才能反转录定量。 无酶水被污染后就不能用了 第一个图中中间那条带有可能是目的条带，但跑的不太好，所以无法确定你的引物是否能用，确定目的条带的方法就是看marker了，将目的条带大小与marker对应。 祝楼主实验顺利 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
6楼2013-07-20 11:03:06
送红花一朵 |
嗯，我是刚开始做的，很不熟练啊，而且会的师姐毕业了，  染色我们都是跑完胶在那个溴化乙锭溶液中泡10-15分钟，可能放的时间长了。trizol是天根的。我是要从组织中提rna，结果提了一次没有提出来，老师让我先从细胞中提取练习。我从小的细胞培养瓶中提rna，查的网上说10平厘米左右加1mltrizol，我就算着加了2ml，吹打时其实发现很多细胞并没有下来。收集细胞应该比较少，提完rna没有定量，就按师姐的以前的量反转录了，最后pcr没有目的条带。那俩跑出来的是师姐以前提的rna反转录出的cdna，我的没有。pcr，单位微升dd水 18.25 10x buffer 2.5 dNTP 2 上引和下引 各0.5（act-u act-d） cDNA 1 taq 0.3 谢谢你，能指点的帮忙指点下。  |
7楼2013-07-22 09:02:49
Sthunder
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【答案】应助回帖
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小瞎子: 金币+2, ★有帮助 2013-07-24 08:41:43
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1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？ DEPC水可以重复使用哈！ 2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？ trizol腐蚀性很强，加入后立即吹打（持续1 min足以），然后静止15 min，一般情况想你可以看到管子里没有明显组织。但这不重要，得到rna后跑个胶，看下带型就ok 3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？ act是常用的看家基因，但不知道你选用的引物具体设计在什么位点，一般我们都不扩全长。 4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？ 明显的那两个带不知道是否是你的act，如果是的话，你的模板应该没有问题。但你选用的pcr退火温度蛮低，而且结果很弥散，根本没明带，所以建议拔高温度试试看。 good luck |
8楼2013-07-22 10:51:20
9楼2013-07-22 15:35:51
hyc_charles
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5