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小瞎子

金虫 (初入文坛)

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[求助] PCR

亲们，最近在细胞中提取RNA,然后反转录，PCR，跑胶，遇到很多问题，想和各位大侠交流一下，不胜感激。
1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？
2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？
3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？
4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？

谢谢，谢谢啊

55℃PCR.jpg

45℃PCR.jpg

IMG_20130712_205646.jpg

IMG_20130712_205711.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ]

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rover

1楼 2013-07-19 10:01:42

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孙启亮

金虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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小瞎子(gyesang代发): 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 12:07:00

致楼主：
首先你的胶咋这样？溴化乙锭加多了吧
感觉你所有的引物都有问题，看引物浓度是不是太高才形成了那么多非特异扩增，若不是，建议重新设计引物。
  楼主的操作应该不是很熟练，不知RNA质量如何，你说的trizol法提RNA不知所用试剂购自哪里，若是inviitrigen的，裂解时间较长，大约15min左右。
  提取的RNA要有质量验证才能反转录定量。
  无酶水被污染后就不能用了
  第一个图中中间那条带有可能是目的条带，但跑的不太好，所以无法确定你的引物是否能用，确定目的条带的方法就是看marker了，将目的条带大小与marker对应。
  祝楼主实验顺利