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小瞎子

金虫 (初入文坛)

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[求助] PCR

亲们，最近在细胞中提取RNA,然后反转录，PCR，跑胶，遇到很多问题，想和各位大侠交流一下，不胜感激。
1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？
2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？
3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？
4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？

谢谢，谢谢啊

55℃PCR.jpg

45℃PCR.jpg

IMG_20130712_205646.jpg

IMG_20130712_205711.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ]

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rover

1楼 2013-07-19 10:01:42

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Sthunder

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小瞎子(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-22 12:57:53
小瞎子: 金币+2, ★有帮助 2013-07-24 08:41:43

1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？
DEPC水可以重复使用哈！
2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？
trizol腐蚀性很强，加入后立即吹打（持续1 min足以），然后静止15 min，一般情况想你可以看到管子里没有明显组织。但这不重要，得到rna后跑个胶，看下带型就ok
3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？
act是常用的看家基因，但不知道你选用的引物具体设计在什么位点，一般我们都不扩全长。
4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？
明显的那两个带不知道是否是你的act，如果是的话，你的模板应该没有问题。但你选用的pcr退火温度蛮低，而且结果很弥散，根本没明带，所以建议拔高温度试试看。

good luck