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小瞎子

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR

亲们,最近在细胞中提取RNA,然后反转录,PCR,跑胶,遇到很多问题,想和各位大侠交流一下,不胜感激。
1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了,是一次性的吗?
2.直接用trizol加入到培养瓶中,感觉吹打半天,放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁,是不是还要继续吹打啊,到底要什么细胞形态才是裂解好啊?
3.pcr用的act作上引和下引,目的条带应该是哪个啊,我不太清楚?
4.下面是我做的一些pcr电泳图,请大家帮我看看,是不是没结果啊?
谢谢,谢谢啊
PCR
55℃PCR.jpg


PCR-1
45℃PCR.jpg


PCR-2
IMG_20130712_205646.jpg


PCR-3
IMG_20130712_205711.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ]
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rover
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小瞎子(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-07-22 12:57:53
小瞎子: 金币+2, 有帮助 2013-07-24 08:41:43
1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了,是一次性的吗?
DEPC水可以重复使用哈!
2.直接用trizol加入到培养瓶中,感觉吹打半天,放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁,是不是还要继续吹打啊,到底要什么细胞形态才是裂解好啊?
trizol腐蚀性很强,加入后立即吹打(持续1 min足以),然后静止15 min,一般情况想你可以看到管子里没有明显组织。但这不重要,得到rna后跑个胶,看下带型就ok
3.pcr用的act作上引和下引,目的条带应该是哪个啊,我不太清楚?
act是常用的看家基因,但不知道你选用的引物具体设计在什么位点,一般我们都不扩全长。
4.下面是我做的一些pcr电泳图,请大家帮我看看,是不是没结果啊?
明显的那两个带不知道是否是你的act,如果是的话,你的模板应该没有问题。但你选用的pcr退火温度蛮低,而且结果很弥散,根本没明带,所以建议拔高温度试试看。

good luck
互助互励,共奋共进!!
8楼2013-07-22 10:51:20
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小瞎子(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩 2013-07-19 12:01:19
就图一中间的两个像是PCR条带,其他都没有
我会绕一个圈,走回到实验室
2楼2013-07-19 10:48:18
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小瞎子

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-07-19 10:48:18
就图一中间的两个像是PCR条带,其他都没有

谢谢啊,那俩个参照啦,其他的能帮忙分析下不
rover
3楼2013-07-19 10:56:16
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小瞎子 at 2013-07-19 10:56:16
谢谢啊,那俩个参照啦,其他的能帮忙分析下不...

额。。。其他的你就当什么都没有吧,没什么值得分析的,下边那点亮多为引物二聚体或者非特异啥的
我会绕一个圈,走回到实验室
4楼2013-07-19 16:22:48
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