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小瞎子

金虫 (初入文坛)

[求助] PCR

亲们，最近在细胞中提取RNA,然后反转录，PCR，跑胶，遇到很多问题，想和各位大侠交流一下，不胜感激。
1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？
2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？
3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？
4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？
谢谢，谢谢啊
PCR
55℃PCR.jpg


PCR-1
45℃PCR.jpg


PCR-2
IMG_20130712_205646.jpg


PCR-3
IMG_20130712_205711.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ]
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rover
1楼 2013-07-19 10:01:42
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小瞎子

金虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 孙启亮 at 2013-07-20 11:03:06
致楼主：
   首先你的胶咋这样？溴化乙锭加多了吧
   感觉你所有的引物都有问题，看引物浓度是不是太高才形成了那么多非特异扩增，若不是，建议重新设计引物。
  楼主的操作应该不是很熟练，不知RNA质量如何，你 ...

嗯，我是刚开始做的，很不熟练啊，而且会的师姐毕业了，染色我们都是跑完胶在那个溴化乙锭溶液中泡10-15分钟，可能放的时间长了。trizol是天根的。我是要从组织中提rna，结果提了一次没有提出来，老师让我先从细胞中提取练习。我从小的细胞培养瓶中提rna，查的网上说10平厘米左右加1mltrizol，我就算着加了2ml，吹打时其实发现很多细胞并没有下来。收集细胞应该比较少，提完rna没有定量，就按师姐的以前的量反转录了，最后pcr没有目的条带。那俩跑出来的是师姐以前提的rna反转录出的cdna，我的没有。pcr，单位微升
dd水            18.25
10x buffer           2.5
dNTP                  2
上引和下引       各0.5（act-u  act-d）
cDNA                  1
taq                     0.3
谢谢你，能指点的帮忙指点下。
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rover
7楼2013-07-22 09:02:49
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小瞎子(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-19 12:01:19
就图一中间的两个像是PCR条带，其他都没有
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我会绕一个圈，走回到实验室
2楼2013-07-19 10:48:18
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小瞎子

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-07-19 10:48:18
就图一中间的两个像是PCR条带，其他都没有

谢谢啊，那俩个参照啦，其他的能帮忙分析下不
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rover
3楼2013-07-19 10:56:16
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 小瞎子 at 2013-07-19 10:56:16
谢谢啊，那俩个参照啦，其他的能帮忙分析下不...

额。。。其他的你就当什么都没有吧，没什么值得分析的，下边那点亮多为引物二聚体或者非特异啥的
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我会绕一个圈，走回到实验室
4楼2013-07-19 16:22:48
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