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小瞎子

金虫 (初入文坛)

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[求助] PCR

亲们，最近在细胞中提取RNA,然后反转录，PCR，跑胶，遇到很多问题，想和各位大侠交流一下，不胜感激。
1.配置好的depc水泡过枪头后是不是就不能用了，是一次性的吗？
2.直接用trizol加入到培养瓶中，感觉吹打半天，放置5分钟后显微镜下看细胞还是很多贴壁，是不是还要继续吹打啊，到底要什么细胞形态才是裂解好啊？
3.pcr用的act作上引和下引，目的条带应该是哪个啊，我不太清楚？
4.下面是我做的一些pcr电泳图，请大家帮我看看，是不是没结果啊？

谢谢，谢谢啊

55℃PCR.jpg

45℃PCR.jpg

IMG_20130712_205646.jpg

IMG_20130712_205711.jpg

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-22 at 16:37 ]

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rover

1楼 2013-07-19 10:01:42

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小瞎子

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引用回帖:

6楼: Originally posted by 孙启亮 at 2013-07-20 11:03:06
致楼主：
首先你的胶咋这样？溴化乙锭加多了吧
感觉你所有的引物都有问题，看引物浓度是不是太高才形成了那么多非特异扩增，若不是，建议重新设计引物。
楼主的操作应该不是很熟练，不知RNA质量如何，你 ...

嗯，我是刚开始做的，很不熟练啊，而且会的师姐毕业了，

染色我们都是跑完胶在那个溴化乙锭溶液中泡10-15分钟，可能放的时间长了。trizol是天根的。我是要从组织中提rna，结果提了一次没有提出来，老师让我先从细胞中提取练习。我从小的细胞培养瓶中提rna，查的网上说10平厘米左右加1mltrizol，我就算着加了2ml，吹打时其实发现很多细胞并没有下来。收集细胞应该比较少，提完rna没有定量，就按师姐的以前的量反转录了，最后pcr没有目的条带。那俩跑出来的是师姐以前提的rna反转录出的cdna，我的没有。pcr，单位微升
dd水          18.25
10x buffer          2.5
dNTP                2
上引和下引    各0.5（act-u  act-d）
cDNA                1
taq                   0.3
谢谢你，能指点的帮忙指点下。