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diedieyi

新虫 (小有名气)

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[交流] 求大神指点，我的基因工程菌是不是退化了？

师姐毕业了，老师让我测定她留下来的，一株导入脂肪酶的酿酒酵母的酶活。参考学姐的方法，我从-20℃冰箱里取出甘油保藏的菌种，在YPD固体培养基中涂布接种，没有加选择压力氨苄青霉素，培养了三天，37℃，观察到固体培养基均匀地长了两种不同的菌落，

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，我以为是杂菌，就用YPD选择培养基，加入选择压力--氨苄青霉素，分离出了目的菌种。然后在固体培养基中连续传代三次，再接种至种子培养基中液体培养（摇床温度30℃，转速200rmp/min），传代三次，每12小时传一代。之所以在液体培养基中传代三次是因为学姐说要多传代几次，这样就可以使得菌种的活力高一些，哎，可我不知道这样对不对。然后，我就将得到的种子培养液接种到了诱导培养基中，所测酶活没有师姐之前测的高，她是70u/mg.min,我是20u/mg.min。我想验证一下诱导培养基没有染菌，于是又用了不加氨苄青霉素的YPD选择培养基（培养条件与之前相同）涂布了诱导培养基里培养出来的菌种，结果发现，菌落形态和之前的发生了比较大的变化，看上去是两种不同的菌。我觉得酶活降低和菌的这些变化有关。
请教各位大神，这到底是怎么回事，是菌种退化了呢，还是我的操作步骤有什么不妥。我刚刚学基因工程，实验室没有人做，只能自己摸索。恳求大神给一些建议！

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1楼 2015-08-12 15:06:35

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hc-material

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。酵母为啥要用37度培养了。负20度保存的菌种稳定期至多3个月。看你师姐有没有保存质粒，重新转化下，若没有，就提下质粒，重新转化下。另外克隆最好保存到负70度可能比较稳定，或者负44度，负20度只能临时保存，另外保存克隆菌时尽量提出质粒，质粒和菌同时保存。克隆菌会变异，但质粒不会，即使菌出问题，然后重新转化下就好了。另外测酶活不一样也很正常，即使是同一个菌，同样的培养方式，用药瓶培养培养出菌的状态也有差别的，比如接种量，种子的活力，等等都会有影响。祝实验顺利。