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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跪求大神指点关于ppic9k载体在酵母中表达
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)

[求助] 跪求大神指点关于ppic9k载体在酵母中表达 已有3人参与

各位大神好，本人分子生物小菜鸟一个。想请教一下关于蛋白用ppic9k这个载体在毕赤酵母中表达方面的知识。
之前我用Bgl2这个酶线性化，毕赤酵母表达手册里面说用这个酶线性化之后电转化酵母得到的是Mut+表型，提取酵母基因组鉴定，用AOX1通用引物时理论上应该能得到两个条带，一个是完整的AOX1基因片段，一个是目的基因片段加上470bp，我的目的基因是500bp左右，因此还有一条条带应该是1000bp左右。结果我的电泳结果显示只有一条1000bp左右的条带，这正常吗？这是为什么呢？
然后我再用目的片段的特异性引物做的验证，电泳结果有一条很目的片段大小差不多的500bp左右的条带。这样我能接着往下进行试验吗？这个现象好像是Muts表型啊。听说Muts表型表达比较慢，是有多慢呢？
问题有点蠢，希望大神多多包涵！

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1楼 2015-08-26 17:32:30
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evil丶zero

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也是做毕赤酵母Ppic 9K的表达。不知道你现在做的怎么样了？
表达手册上有MUTS的生长描述MM培养基上处于对数期MUT+的倍增时间为4-6小时
muts为18小时
另外，菌种不同时间也有差异。
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肉肉肉.
9楼2015-11-06 16:02:40
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普通回帖

肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
哎呀我说错了 我线性化用的是Sal1这个酶

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2楼2015-08-26 17:59:33
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
内容已删除
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3楼2015-08-27 11:33:46
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肉肉肉.

铁虫 (小有名气)
来人啊
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4楼2015-08-27 15:34:22
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halfbeer

捐助贵宾 (小有名气)

这是啥？
我想问下，你是怎么提的酵母基因组啊，谢谢
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现在我们能做的就是努力努力再努力
5楼2015-09-07 08:26:26
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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6楼2015-10-16 11:06:59
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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7楼2015-10-16 11:07:47
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
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8楼2015-10-16 11:09:31
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uranuser

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

就应该是一个条带吧？因为你已经把目的片段转入了基因组，在组氨酸平板上长出的就是含有目的基因的菌。
另外，Muts型慢也不要紧，关键是表达量，如果Muts型表达量比Mut+型高，那就用Muts型
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肉肉肉.
10楼2015-11-13 09:53:52
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